良好的菌种是微生物发酵工业的基础。在应用微生物生产各类食品时，首先是选种的问题，要挑选出符合需要的菌种，一方面可以根据有关信息向菌种保藏机构、工厂或科研单位直接索��；另一方面根据所需菌种的形态、生理、生态和工艺特点的要求，从自然界特定的生态环境中以特定的方法分离出新菌株。其次是育种的工作，根据菌种的遗传特点，改良菌株的生产性能，使产品产量、质量不断提高。第三当菌种的性能下降时，还要设法使它复壮。最后还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合，这样菌种的优良性能才能充分发挥。
4.1. 自然界工业菌种筛选程序
我国幅员辽阔，各地气候条件、土质条件、植被条件差异很大，这为自然界中各种微生物的存在提供了良好的生存环境。自然界中微生物种类繁多，估计不少于几十万种，但目前已为人类研究及应用的不过千余种。由于微生物到处都有，无孔不入，所以它们在自然界大多是以混杂的形式群居于一起的。而现代发酵工业是以纯种培养为基础，故采用各种不同的筛选手段，挑选出性能良好、符合生产需要的纯种是工业育种的关键一步。自然界工业菌种分离筛选的主要步骤是：采样、增殖培养、培养分离和筛选。如果产物与食品制造有关，还需对菌种进行毒性鉴定。
4.1.1. 采样
以采集土壤为主。一般在有机质较多的肥沃土壤中，微生物的数量最多，中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主，酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多，果园、菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。采样应充分考虑采样的季节性和时间因素，以温度适中，雨量不多的秋初为好。因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的，如在夏季或冬季土壤中微生物存活数量较少，暴雨后土壤中微生物会显著减少。采样方式是在选好适当地点后，用无菌刮铲、土样采集器等，采集有代表性的样品，如特定的土样类型和土层，叶子碎屑和腐质，根系及根系周围区域，海底水，泥及沉积物，植物表皮及各部，阴沟污水及污泥，反色动物第一胃内含物，发酵食品等。
具体采集土样时，就森林、旱地、草地而言，可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；就水田等浸水土壤而言，一般是在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5~15cm处的土。将采集到的土样盛入清洁的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等。采好的样品应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。如果要分离嗜冷菌，则在室温下保存试样会使嗜冷菌数量明显降低。
在采集植物根际土样时，一般方法是将植物根从土壤中慢慢拔出，浸渍在大量无菌水中约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分土即为根际土样。
在采集水样时，将水样收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，应从较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶浸入水中30~50cm处，瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。水样采集完毕时，应迅速从水中取出采集瓶并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶，采集的水样应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。
4.1.2. 增殖培养
一般情况下，采来的样品可以直接进行分离，但是如果样品中我们所需要的菌类含量并不很多，而另一些微生物却大量存在。此时，为了容易分离到所需要的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，即设法增加所要菌种的数量，以增加分离的几率�？梢酝ü≡裥缘呐渲婆嘌ㄈ缬煞�、添加抑制剂等），选择一定的培养条件（如培养温度、培养基酸碱度等）来控制。具体方法是根据微生物利用碳源的特点，可选定糖、淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其他微生物就可能死亡或淘汰。对G一菌有选择的培养基(如结晶紫营养培养基、红—紫胆汁琼脂、煌绿胆汁琼脂等)通常含有5%~10%的天然提取物。在分离细菌时，培养基中添加浓度一般为50μg／m1的抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，可以抑制真菌的生长。在分离放线菌时，通常于培养基中加入1~5m1天然浸出汁(植物、岩石、有机混合腐质等的浸出汁) 作为最初分离的促进因子，由此可以分离出更多不同类型的放线菌类型；放线菌还可以十分有效地利用低浓度的底物和复杂底物(如几丁质)，因此，大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的，而不是在含丰富营养的生长培养基上分离的；在放线菌分离琼脂中通常加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖；此外，为了对某些特殊种类的放线菌进行富集和分离，可选择性地添加一些抗生素(如新生霉素)。在分离真菌时，利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数、分离和签定；在分离培养基中加入一定的抗生素如氯霉素、四环素、卡那霉素、青霉素、链霉素等即可有效地抑制细菌生长及其菌落形成；抑制细菌的另外一些方法有：在使用平皿之前，将平皿先干燥3~4天；降低培养基的pH值或在无法降低pH时，加入1：30000玫瑰红。这样有利于下阶段的纯种分离。
4.1.3. 培养分离
通过增殖培养，样品中的微生物还是处于混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且要控制得细一点，好一点。同时必须进行纯种分离，常用的分离方法有稀释分离法、划线分离法和组织分离法。稀释分离法的基本方法是将样品进行适当稀释，然后将稀释液涂布于培养基平板上进行培养，待长出独立的单个菌落，进行挑选分离�；叻掷敕ㄒ紫鹊古嘌桨�，然后用接种针（接种环）挑取样品，在平板上划线�；叻椒ǹ捎梅植交叻ɑ蛞淮位叻�，无论用哪种方法，基本原则是确保培养出单个菌落。组织分离法主要用于食用菌菌种或某些植物病原菌的分离。分离时，首先用10%漂白粉或0.1%升汞液对植物或器官组织进行表面消毒，用无菌水洗涤数次后，移植到培养皿中的培养基上，于适宜温度培养数天后，可见微生物向组织块周围扩展生长。经菌落特征和细胞特征观察确认后，即可由菌落边缘挑取部分菌种进行移接斜面培养。
对于有些微生物如毛霉、根霉等在分离时，由于其菌丝的蔓延性，极易生长成片，很难挑取单菌落。常在培养基中添加0.1%的去氧胆酸钠或在察氏培养基中添加0.1%的山梨糖及0.01%的蔗糖，利于单菌落的分离。
4.1.4. 筛选
经过分离培养，在平板上出现很多单个菌落，通过菌落形态观察，选出所需菌落，然后取菌落的一半进行菌种鉴定，对于符合目的菌特性的菌落，可将之转移到试管斜面纯培养。这种从自然界中分离得到的纯种称为野生型菌株，它只是筛选的第一步，所得菌种是否具有生产上的实用价值，能否作为生产菌株，还必须采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。如果此野生型菌株产量偏低，达不到工业生产的要求，可以留之作为菌种选育的出发菌株。
4.1.5. 毒性试验
自然界的一些微生物在一定条件下将产生毒素，为了保证食品的安全性，凡是与食品工业有关的菌种，除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌无须作毒性试验外，其他微生物均需通过两年以上的毒性试验。
4.2. 微生物的诱变育种
从自然界直接分离的菌种，一般而言其发酵活力往往是比较低的，不能达到工业生产的要求，因此要根据菌种的形态、生理上的特点，改良菌种。以微生物的自然变异为基础的生产选种的几率并不高，因为这种变异率太小，仅为10—6~10—10。为了加大其变异率，采用物理和化学因素促进其诱发突变，这种以诱发突变为基础的育种就是诱变育种，它是国内外提高菌种产量、性能的主要手段。 诱变育种具有极其重要的意义，当今发酵工业所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能。诱变育种不仅能提高菌种的生产性能而且能改进产品的质量、扩大品种和简化生产工艺等。从方法上讲，它具有方法简便、工作速度快和效果显著等优点。因此，虽然目前在育种方法上，杂交、转化、转导以及基因工程、原生质体融合等方面的研究都在快速地发展，但诱变育种仍为目前比较主要、广泛使用的育种手段。
4.2.1. 诱变育种的步骤和方法
诱变育种的步骤如下（图5－18）：
图5－18. 诱变育种的步骤
出发菌株的选择 用来进行诱变或基因重组育种处理的起始菌株称为出发菌株。在诱变育种中，出发菌株的选择，会直接影响到最后的诱变效果，因此必须对出发菌株的产量、形态、生理等方面有相当的了解，挑选出对诱变剂敏感性大、变异幅度广、产量高的出发菌株。具体方法是选取自然界新分离的野生型菌株，它们对诱变因素敏感，容易发生变异；选取生产中由于自发突变或长期在生产条件下驯化而筛选得到的菌株，与野生型菌株较相象，容易达到较好的诱变效果；选取每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变可能效果迭加，积累更多的提高。另外，出发菌株还可以同时选取2~3株，在处理比较后，将更适合的菌株留着继续诱变。
另外，对于基因重组的出发菌株，无论是供体还是受体，都必须考虑与重组方式对应的基本性能，如感受态、性亲和性、噬菌体吸附位点等，还必须考虑标记互补、选择性性状、受菌体的强代谢活性、营养需求、生长速度等，以及与社会公害有关的问题如耐药性、致病性、肠道寄生性等。
同步培养 在诱变育种中，处理材料一般采用生理状态一致的单倍体、单核细胞，即菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态，这称为同步培养。细菌一般要求培养至对数生长期，此时群体生长状态比较同步，比较容易变异，重复性较好。如亚硝基胍诱变时作用于复制叉处，生长旺盛的细胞中复制叉点较多，碱基类似物也在此时期比较容易进入DNA链中。霉菌处理使用分生孢子，应该将分生孢子在液体培养基中短时间培养，使孢子孵化，处于活化状态，并恰好未形成菌丝体，易于诱变。
单细胞(或单孢子) 悬液的制备 这一步的关键是制备一定浓度的分散均匀的单细胞或单孢子悬液，为此要进行细胞的培养，并收集菌体、过滤或离心、洗涤。菌悬液一般可用生理盐水或缓冲溶液配制，如果是用化学诱变剂处理，因处理时 pH值会变化，必须要用缓冲溶液。除此之外，还应注意分散度，方法是先用玻璃珠振荡分散，再用脱脂棉或滤纸过滤，经处理，分散度可达90％以上，这样，可以保证菌悬液均匀地接触诱变剂 ，获得较好诱变效果。最后制得的菌悬液，霉菌孢子或酵母菌细胞的浓度大约为106~107个／ml，放线菌和细菌的浓度大约为108个／ml。菌悬液的细胞可用平板计数法、血球计数板或光密度法测定，但以平板计数法较为准确。
诱变处理 首先选择合适的诱变剂，然后确定其使用剂量。常用诱变剂有两大类：物理诱变剂和化学诱变剂。 常用的物理诱变剂有紫外线、x射线、γ射线(如Co60等)、等离子、快中子、α射线、β射线、超声波等。常用的化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等。
物理诱变剂中最常用的有紫外线。由于紫外线不需要特殊贵重设备，只要普通的灭菌紫外灯管即能做到，而且诱变效果也很显著，因此被广泛应用于工业育种。紫外线是波长短于紫色可见光而又紧接紫色光的射线、波长范围为136～300nm，紫外线波长范围虽宽，但有效范围仅限于一个小区域，多种微生物最敏感的波长集中在265nm处，对应于功率为15W的紫外灯。它是一种非电离辐射，当物质吸收一定能量的紫外线后，它的某些电子将被提升到较高的能量水平，从而引起分子激发而造成突变；而不吸收紫外线的物质，能量不发生转移，分子也不会激发，不会产生任何化学变化，然而，脱氧核糖核酸能大量吸收紫外线，因此它极容易受紫外线的影响而变化。紫外线的诱变作用是由于它引起DNA分子结构变化而造成的。这种变化包括DNA链的断裂，DNA分子内和分子间的交连，核酸与蛋白质的交联，嘧啶水合物和嘧啶二聚体的产生等，特别是嘧啶二聚体的产生对于DNA的变化起主要作用。
紫外诱变的方法是：将10m1菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器，使用15w功率紫外灯管，照射距离为30cm左右，照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株需处理10 min左右。为准确起见，照射前紫外灯应先预热20~30min，然后再进行处理。不同的微生物对于紫外线的敏感程度不一样，因此不同的微生物对于诱变所需要的剂量也不同。在紫外灯的功率、照射距离已定的情况下，决定照射剂量的只有照射时间，这样可以设计一个照射不同时间梯度的实验，根据不同时间照射的死亡率，作出照射时间与死亡率的曲线，这样就可以选择适当的照射剂量。一般以照射后微生物的致死率在90%~99.9% 的剂量为最佳照射剂量，近来也有倾向于采用杀菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的剂量。一般认为，偏低的剂量处理后正突变率较高，而用较高的剂量时则负突变率较高，但高剂量造成损伤大、回复少。目前趋向采用低剂量、长时间处理，尽管致死率较高，而诱变效果较好。实验时，为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红光下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛选。
CO60属γ射线，是一种高能电磁波，其诱发的突变率和射线剂量直接有关，而与时间长短无关。它能产生电离作用，直接和间接改变DNA结构。直接的效应是导致碱基的化学键、脱氧核糖的化学键、糖-磷酸相连接的化学键的断裂；间接的效应是电离辐射使水和有机分子产生自由基，自由基作用于DNA分子，特别是对嘧啶的作用更强，可引起缺失和损伤，造成基因突变，还能引起染色体断裂，引起倒位、缺失和易位等畸变。不同的微生物对C060的辐射敏感程度差异很大，可以相差几倍，引起最高变异的剂量也随菌种而有所不同。一般照射时多采用菌悬液，也可用长了菌落的平皿直接照射。照射剂量在4~10万伦琴，或者采用能使微生物产生90％~99％死亡率的剂量。电离幅射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺失突变，但可能影响邻近基因的性能。
等离子输入是一种较新的诱变方法，国外自20世纪60年代中、后期相继开始把等离子注入技术应用于生物学领域的研究，国内将离子束作为一种新技术应用于生物等品种改良的研究则是由中国科学院等离子体物理研究所于1986年开创的。低能离子束是以具质量、能量双重诱变效应的特征不同于传统的电磁辐射，它的注入引发的生物效应，机制相当复杂，既有能量的沉积、动量的传递，又有粒子的注入和电荷的交换，可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和膜电场的改良，与γ射线，中子束等明显不同。离子束与生物体作用，首先有能量的沉积，即注入离子与生物大分子发生一系列碰撞，生物大分子获得能量时，键断裂，分子击出原位，留下断键或缺陷；同时还有质量沉积，离子束是高LET粒子，有Braag峰，具有较强的电离作用，还能产生活性高的自由基间接损伤作用，因此它对生物体的作用可导致较高的突变率；另外由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量的组合，提供了众多的诱变条件，通过这种电、能、质的联合作用，将强烈影响生物细胞的生理生化特性，以引起基因突变，所以变异幅度大，有较高的突变率，较广的突变谱；再者突变体的遗传性能比较稳定，回复突变率低。
化学诱变剂 化学诱变剂的种类很多，根据它们对DNA的作用机制，可以分为三大类：第一类是烷化剂，它与一个或多个核酸碱基起化学变化，因而引起DNA复制时碱基配对的转换而发生变异。例如硫酸二乙酯、亚硝酸、甲基磺酸乙酯、N-甲基-N’-亚硝基胍、亚硝基甲基尿等。第二类是一些碱基类似物，它们通过代谢作用渗入到DNA分子中而引起变异，例如 5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘌呤、2-氨基嘌呤、8-氮鸟嘌呤等。第三类是吖啶类，它造成DNA分子增加或减少一、二个碱基，从而引起碱基突变点以下全部遗传密码在转录和翻译时产生错误。选择化学诱变剂时还应注意：亚硝胺和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多，其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯被称为“超诱变剂”， 甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。碱基类似物和羟胺虽然具有很高的特异性，但很少使用，因其回复突变率高，效果不大。
决定化学诱变剂剂量的因素主要有诱变剂的浓度、作用温度和作用时间。化学诱变剂的处理浓度常用几微克~几毫克／毫升，但是这个浓度取决于药剂、溶剂及微生物本身的特性，还受水解产物的浓度、一些金属离子以及某些情况下诱变剂的延迟作用的影响。一般对于一种化学诱变剂，处理浓度对不同微生物有一个大致范围，在进行预试验时，也通常是将处理浓度、处理温度确定后，测定不同时间的致死率来确定适宜的诱变剂量。这里需要说明的是化学诱变剂与物理诱变剂不同，在处理到确定时间后，要有合适的终止反应方法，一般采用稀释法、解毒剂或改变pH值等方法来终止反应。
要确定一个合适的剂量，通常要经过多次试验，就一般微生物而言，诱变频率往往随剂量的增高而增高，但达到一定剂量后，再提高剂量会使诱变频率下降。根据对紫外线、x 射线及乙烯亚胺等诱变剂诱变效应的研究，发现正突变较多地出现在较低的剂量中。而负突变则较多地出现在高剂量中，同时还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，高剂量更容易出现负突变。因此，在诱变育种工作中，目前较倾向于采用较低剂量。
在诱变育种时，有时可根据实际情况，采用多种诱变剂复合处理的办法。复合处理方法主要有三类：第一类是两种或多种诱变剂先后使用；第二类是同一种诱变剂的重复使用；第三类是两种或多种诱变剂的同时使用。如果能使用不同作用机制的诱变剂来做复合处理，可能会取得更好的诱变效果。诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效应，这对诱变育种的工作是很有价值的。
中间培养 对于刚经诱变剂处理过的菌株，有一个表现迟滞的过程，即细胞内原酶有量的稀释过程（生理延迟），需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。据此应让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，稳定的变异就会显现出来。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。
分离和筛选 经过中间培养，分离出大量的较纯的单个菌落，接着，要从几千万个菌落中筛选出几个好的，即筛选出所谓性能良好的正突变菌株，这将要花费大量的人力和物力。怎样设计才能花费较少的工作量达到最好的效果，这是筛选工作中的一条原则。一般采用一些方法加以简化，如利用形态突变直接淘汰低产变异菌株，或利用平皿反应直接挑取高产变异菌株等。平皿反应是指每个变异菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物在培养基平板上作用后表现出一定的生理效应，如变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等，这些效应的大小表示变异菌株生产活力的高低，以此作为筛选的标志。常用的方法有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等。
4.2.2. 营养缺陷型突变体的筛选及应用
在诱变育种工作中，营养缺陷型突变体的筛选及应用有着十分重要的意义。营养缺陷型菌株是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质(如氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶碱基等)的能力，必须在其基本培养基中加入相应缺陷的营养物质才能正常生长繁殖的变异菌株。其变异前的菌株称为野生菌株。凡是能满足野生菌株正常生长的最低成分的合成培养基，称为基本培养(MM)；在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质，如蛋白质、酵母膏等，能满足各种营养缺陷型菌株生长繁殖的培养基，称为完全培养基(CM)；在基本培养基中只是有针对性的加入某一种或某几种自身不能合成的有机营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长的培养基，称为补充培养基(SM)。
营养缺陷型菌株的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型和确定生长谱四个环节。诱变剂处理时与其它诱变处理基本相同。在诱变处理后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般很低，通常只有百分之几至千分之几，采用抗菌素法或菌丝过滤法，可以淘汰为数众多的野生型菌株，从而达到浓缩营养缺陷型的目的�？股胤ㄊ抢靡吧途昴茉贛M中生长，而缺陷型不能生长，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于“休眠状态”，这时，加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。在选择抗生素时，细菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。 菌丝过滤法只适用于丝状真菌，其原理是在基本培养基中，野生型的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型则不能。因此将诱变处理后的孢子在基本培养基中培养一段时间后，再进行过滤。如此重复数次后，就可以除去大部分野生型菌株，同样达到“浓缩”营养缺陷型的目的。
营养缺陷型的检出方法很多，主要有影印法、夹层法、逐个检出法、限量补充培养法等四种。影印法是将诱变处理后的细胞涂布在完全培养基表面上，经培养后长出菌落，然后用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块复盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具，将长出菌落的平皿倒转过来，在丝绒上轻轻按一下，转接到另一基本培养基平板上，经培养后，比较这两个平皿长出的菌落。如果发现前一平扳上某一部位长有菌落，而在后一培养基上的相应部位却没有，就说明这是一个营养缺陷型菌落。夹层培养法是先在培养皿上倒一层基本培养基，冷凝后加上一层含菌液的基本培养基，凝固后再浇上一薄层的基本培养基。经培养后，在皿底对首先出现的菌落做标记，然后再倒上一薄层完全培养基(或补充培养基)，再培养，这时再出现的新菌落，多数即为营养缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。逐个检出法是将经过诱变处理的细胞涂布在完全培养基平板上，待长出单个菌落后，用接种针或牙签将这些单个菌落逐个依次地分别接种到基本培养基和另一完全培养基平板上。经培养后，如果在完全培养基上长出菌落，而在基本培养基上却不长菌落，说明这是一个营养缺陷型菌株。限量补充培养法是将诱变处理后的细胞接种在含有微量(0.01％以下)蛋白胨的基本培养基上。野生型菌株就会迅速生长成较大的菌落，而营养缺陷型菌株只能形成生长缓慢的微小菌落，因而可以识别检出。如果想得到某一特定缺陷型菌株，则可直接在基本培养基上加入微量的相应物质。
确定生长谱是指采用上法选出的缺陷型菌株经几次验证确定后，还需确定其缺陷的因子，是氨基酸缺陷型，还是维生素缺陷型，或是嘌呤、嘧啶缺陷型。生长谱测定可以用两种方法：一种是将缺陷型菌株培养后，收集菌体，洗涤培养基，制备成细胞悬液后，与MM培养基（融化并凉至50°C）混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的5~6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组织营养物的滤纸圆片，培养后会在组合区长出，就可测得所需营养。另一种方法是以不同组合的营养混合物与融化凉至50°C的MM培养基铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于相应位置，培养后根据在什么组合长出可推知其营养因子。
营养缺陷型菌株不论在科学实验中，还是在生产实践中都具有广泛的用途。利用营养缺陷型菌株定量分析各种生长因素的方法称为微生物分析法。常用于分析食品中氨基酸和维生素的含量，因为在一定浓度范围内，营养缺陷型菌株生长繁殖的数量与其所需维生素和氨基酸的量成正比。这种方法特异性强，灵敏度高，所用样品可以很少而且不需提纯，也不需要复杂的仪器设备。 利用营养缺陷型菌株作为研究转化、转导、接合等遗传规律的标记菌种和微生物杂交育种的标记。由于微生物经杂交育种后形成的杂种在形态上往往与亲本难以区别，因此常常选择不同的营养缺陷型来进行标记，通过测定后代的营养特性，以判断它们杂交的性质。利用营养缺陷型菌株测定微生物的代谢途径，并通过有意识地控制代谢途径，获得更多的我们所需要的代谢产物，从而成为发酵生产氨基酸、核苷酸和各种维生素等的生产菌种，例如利用丝氨酸营养缺陷型可以生产更多的赖氨酸，利用腺苷酸营养缺陷型菌株可提高肌苷酸的产量等。
4.3. 微生物的杂交育种
杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经细胞的互相联结、细胞核融合，随后细胞核进行减数分裂，遗传性状会出现分离和重新组合的现象，产生具有各种新性状的重组体，然后经分离和筛选，获得符合要求的生产菌株。尽管一些优良菌种的选育主要是采用诱变育种的方法，但是某一菌株长期使用诱变剂处理后，其生活能力一般要逐渐下降，如生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢、产量增加缓慢、诱变因素对产量基因影响的有效性降低等。因此，常采用杂交育种的方法继续优化菌株。另外，由于杂交育种是选用已知性状的供体和受体菌种作为亲本，因此不论在方向性还是自觉性方面，都比诱变育种前进了一大步，所以它是微生物菌种选育的另一重要途径。但由于杂交育种的方法复杂，工作进度慢，因此还很难象诱变育种那样得到普遍的推广和应用。
4.3.1. 细菌的杂交
细菌的杂交行为是于1946年首次在大肠杆菌K-12菌株中发现并证实的。首先在大肠杆菌K-12菌株中诱发一个营养缺陷型(A—)、不能发酵乳糖(Lac—)和抗链霉素(SM r )以及对噬菌体T l敏感的突变体，可以写成A—B +Lac—SM r T s1；另一菌株诱发成一个营养缺陷型(B—)，能发酵乳糖(Lac+)，对链霉菌敏感(SM s)和抗噬菌体T l的突变体A+B—Lac +SM s T r 1。这两个菌株各自都不能在基本培养基上生长，如果把大约105 /ml浓度的上述两种菌株混合在一起，并接种在基本培养基上，则能长出少数菌落；如果把上述两种菌株分别接种到一个特制的U型管的两端去培养,中间用一片可以使培养液流通,但不能使细菌通过的烧结玻璃隔开,那么在基本培养基上就不会出现菌落。这说明细胞的接触是导致基因重组的必要条件，即细菌通过接合完成了杂交行为。在鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、肺炎克氏杆菌、霍乱弧菌等许多细菌中也发现了没接合现象，但是至今未在革兰氏阳性菌中发现接合现象。细菌的杂交还可以通过F因子转移,转化和转导等发生基因重组,但通过这些方式进行杂交育种获得成功的报道还不多。
4.3.2. 放线菌的杂交育种
放线菌的基因重组于1955年至1957年首先在天蓝链霉菌中发现,以后在其它科、属、种中相继发现。现在常用的放线菌杂交方法主要有三种,即混合培养法、平板杂交法和玻璃纸转移法。国外在金霉素、土霉素、新生霉素等抗生素产生菌的杂交育种方面都有过成功的报道,在我国几乎与国外同时起步开展放线菌基因重组的研究工作,并取得了一定成效。
4.3.3. 酵母的杂交育种
一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。酵母的杂交方法有孢子杂交法，群体交配法，单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。
4.3.4. 霉菌的杂交育种
霉菌的杂交育种主要是通过体细胞的核融合和基因重组，即通过准性生殖过程而不是通过性细胞的融合。
霉菌的杂交育种的步骤为：第一 选择直接亲本。用来进行杂交的两个野生型菌株叫原始亲本。原始亲本经过诱变以后得到各种突变型菌株,假设这种菌株是用来作为形成异核体的亲本,就叫直接亲本。作为直接亲本的遗传标记有多种，如营养突变型、抗药突变型、形态突变型等,目前应用普遍的是营养缺陷型菌株。第二是异核体的形成。在基本培养基上,强迫两株营养缺陷型互补营养，则这两个菌株经过菌丝细胞间的吻合形成异核体。由直接亲本形成异核体的方法有：完全培养基液体混合培养法、完全培养基斜面混合培养法、液体有限培养基混合培养法、有限培养基平板异核丛形成法、基本培养基斜面衔接接种法、基本培养基平板穿刺法等。第三是双倍体的检出，检出双倍体的方法有很多种，如用放大镜观察异核体菌落表面，如果发现有野生型颜色的斑点和扇面，即可用接种针将其孢子挑出，进行分离纯化，即得杂合双倍体�；蛘呓罅恳旌颂彐咦臃掷胗诨九嘌桨迳洗又谐こ鲆吧驮跃洌涮舫龇掷氪炕�，即得杂合双倍体。第四是分离子的检出�？梢杂醚≡裥耘嘌秆》掷胱樱部梢越雍纤短宓ユ咦臃掷胗谕耆嘌桨迳�，培养至菌落成熟，检查大量双倍体菌落，在一些菌落上有突变颜色（隐性标记）的斑点或扇面出现，从每个菌落接出一个斑点或扇面的孢子于完全培养基斜面上，培养后经过纯化和鉴别即得分离子。
4.4. 原生质体育种
原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化，原生质体诱变育种等。原生质体融合育种是基因重组的一种重要方法，由于它具有一系列的特点，所以目前已为国内外微生物育种学者所广泛研究和应用。
由于细胞壁是微生物细胞之间进行物质交换的主要障碍之一，用一些方法将细胞壁去除后在高渗条件下形成类似球形的原生质体，在原生质体融合时又加入融合促进剂聚乙二醇（PEG）和Ca++，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交法，霉菌与放线菌已达10—l ~10—2，细菌与酵母已达10-5~10-6。原生质体融合受接合型或致育型的限制较小，二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。已报道的丝状真菌种间的原生质体融合主要是曲霉属和青霉属；属间原生质体融合主要在酵母中实现：热带假丝酸母×饰针复膜孢酵母，酿酒酵母×彭贝裂殖酵母等。原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程，因此可以想象遗传物质的交换更为完整，提高菌株产量的潜力更大。原生质体融合可以是两株以上的亲株同时参与融合，如研究表明两个亲株的融合频率为2.8×10-2，三个亲株的融合频率为4×10-4，四个亲株的融合频率为4.9×10-7。
原生质体融合育种的步骤是：标记菌株的筛选和稳定性验证 ，原生质体制备，等量原生质体加聚乙二醇促进融合，涂布于再生培养基、再生出菌落，选择性培养基上划线生长、分离验证、挑取融合子进一步试验保藏，生产性能筛选。
前面已经提到转化在工业微生物遗传改良及基因工程中占有十分重要的地位。但除少数细菌外，多数微生物的自然转化能力很低，特别是真核微生物几乎很少能发现自然转化。这主要是因为转化的必备条件之一是感受态的存在，经过人工诱导法可使一些微生物获得感受态，已成功的例子如枯草芽抱杆菌、大肠杆菌等并得到广泛应用。但在链霉菌及真菌中，人工诱导法实现完整细胞的转化的成功例子就不多了。原生质体技术出现后不久，Bibb等发现，当有PEG存在时，质粒DNA可以很高频率转化链霉菌原生质体，从而彻底摆脱了转化依赖感受态出现的限制。在真菌中巳成功地进行原生质体转化的菌株如酿酒酵母、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉等。
图5－19. 基因工程技术的主要操作步骤示意图
4.5. 基因工程技术用于工业菌种改良
基因工程技术又称基因操作、基因克隆、DNA重组等，是一个将含目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，转入一个受体细胞并使之扩增、表达的过程。因此比其它育种方法更有目的性和方向性，效率更高。其全部过程大体可分为以下6个步骤（如图5－19）：目的基因的获得；载体的选择；含目的基因的DNA片段克隆入载体中构成重组载体；将重组载体引入宿主细胞内进行复制、扩增；筛选出带有重组目的基因的转化细胞；鉴定外源基因的表达产物。
目的基因的获得 目的基因的获得一般有四条途径；从生物细胞中提取、纯化染色体DNA并经适当的限制性内切酶部分酶切；经反转录酶的作用由mRNA在体外合成互补DNA(cDNA)，此主要用于真核微生物及动，植物细胞中特定基因的克隆；化学合成，主要用于那些结构简单、核苷酸顺序清楚的基因的克��；从基因库中筛选、扩增获得，目前认为是取得任何目的基因的最好和最有效的方法。
载体的选择 基因工程中所用的载体系统主要有细菌质粒、粘性质粒、酵母菌质粒、λ噬菌体、动物病毒等。载体一般为环状DNA，能在体外经限制酶及DNA连接酶的作用同目的基因结合成环状DNA (即重组DNA)，然后经转化进入受体细胞大量复制和表达。
重组栽体的构建 DNA体外重组是将目的基因用DNA连接酶连接到合适的载体DNA上，可采用粘端连接法和末端连接法。
工程菌的获得 经重组DNA的转化与鉴定，得到符合原定的“设计蓝图”的工程菌。
4.1. 自然界工业菌种筛选程序
我国幅员辽阔，各地气候条件、土质条件、植被条件差异很大，这为自然界中各种微生物的存在提供了良好的生存环境。自然界中微生物种类繁多，估计不少于几十万种，但目前已为人类研究及应用的不过千余种。由于微生物到处都有，无孔不入，所以它们在自然界大多是以混杂的形式群居于一起的。而现代发酵工业是以纯种培养为基础，故采用各种不同的筛选手段，挑选出性能良好、符合生产需要的纯种是工业育种的关键一步。自然界工业菌种分离筛选的主要步骤是：采样、增殖培养、培养分离和筛选。如果产物与食品制造有关，还需对菌种进行毒性鉴定。
4.1.1. 采样
以采集土壤为主。一般在有机质较多的肥沃土壤中，微生物的数量最多，中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主，酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多，果园、菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。采样应充分考虑采样的季节性和时间因素，以温度适中，雨量不多的秋初为好。因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的，如在夏季或冬季土壤中微生物存活数量较少，暴雨后土壤中微生物会显著减少。采样方式是在选好适当地点后，用无菌刮铲、土样采集器等，采集有代表性的样品，如特定的土样类型和土层，叶子碎屑和腐质，根系及根系周围区域，海底水，泥及沉积物，植物表皮及各部，阴沟污水及污泥，反色动物第一胃内含物，发酵食品等。
具体采集土样时，就森林、旱地、草地而言，可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；就水田等浸水土壤而言，一般是在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5~15cm处的土。将采集到的土样盛入清洁的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等。采好的样品应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。如果要分离嗜冷菌，则在室温下保存试样会使嗜冷菌数量明显降低。
在采集植物根际土样时，一般方法是将植物根从土壤中慢慢拔出，浸渍在大量无菌水中约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分土即为根际土样。
在采集水样时，将水样收集于100m1干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，应从较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶浸入水中30~50cm处，瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。水样采集完毕时，应迅速从水中取出采集瓶并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶，采集的水样应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。
4.1.2. 增殖培养
一般情况下，采来的样品可以直接进行分离，但是如果样品中我们所需要的菌类含量并不很多，而另一些微生物却大量存在。此时，为了容易分离到所需要的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，即设法增加所要菌种的数量，以增加分离的几率�？梢酝ü≡裥缘呐渲婆嘌ㄈ缬煞�、添加抑制剂等），选择一定的培养条件（如培养温度、培养基酸碱度等）来控制。具体方法是根据微生物利用碳源的特点，可选定糖、淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其他微生物就可能死亡或淘汰。对G一菌有选择的培养基(如结晶紫营养培养基、红—紫胆汁琼脂、煌绿胆汁琼脂等)通常含有5%~10%的天然提取物。在分离细菌时，培养基中添加浓度一般为50μg／m1的抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，可以抑制真菌的生长。在分离放线菌时，通常于培养基中加入1~5m1天然浸出汁(植物、岩石、有机混合腐质等的浸出汁) 作为最初分离的促进因子，由此可以分离出更多不同类型的放线菌类型；放线菌还可以十分有效地利用低浓度的底物和复杂底物(如几丁质)，因此，大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的，而不是在含丰富营养的生长培养基上分离的；在放线菌分离琼脂中通常加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖；此外，为了对某些特殊种类的放线菌进行富集和分离，可选择性地添加一些抗生素(如新生霉素)。在分离真菌时，利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数、分离和签定；在分离培养基中加入一定的抗生素如氯霉素、四环素、卡那霉素、青霉素、链霉素等即可有效地抑制细菌生长及其菌落形成；抑制细菌的另外一些方法有：在使用平皿之前，将平皿先干燥3~4天；降低培养基的pH值或在无法降低pH时，加入1：30000玫瑰红。这样有利于下阶段的纯种分离。
4.1.3. 培养分离
通过增殖培养，样品中的微生物还是处于混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且要控制得细一点，好一点。同时必须进行纯种分离，常用的分离方法有稀释分离法、划线分离法和组织分离法。稀释分离法的基本方法是将样品进行适当稀释，然后将稀释液涂布于培养基平板上进行培养，待长出独立的单个菌落，进行挑选分离�；叻掷敕ㄒ紫鹊古嘌桨�，然后用接种针（接种环）挑取样品，在平板上划线�；叻椒ǹ捎梅植交叻ɑ蛞淮位叻�，无论用哪种方法，基本原则是确保培养出单个菌落。组织分离法主要用于食用菌菌种或某些植物病原菌的分离。分离时，首先用10%漂白粉或0.1%升汞液对植物或器官组织进行表面消毒，用无菌水洗涤数次后，移植到培养皿中的培养基上，于适宜温度培养数天后，可见微生物向组织块周围扩展生长。经菌落特征和细胞特征观察确认后，即可由菌落边缘挑取部分菌种进行移接斜面培养。
对于有些微生物如毛霉、根霉等在分离时，由于其菌丝的蔓延性，极易生长成片，很难挑取单菌落。常在培养基中添加0.1%的去氧胆酸钠或在察氏培养基中添加0.1%的山梨糖及0.01%的蔗糖，利于单菌落的分离。
4.1.4. 筛选
经过分离培养，在平板上出现很多单个菌落，通过菌落形态观察，选出所需菌落，然后取菌落的一半进行菌种鉴定，对于符合目的菌特性的菌落，可将之转移到试管斜面纯培养。这种从自然界中分离得到的纯种称为野生型菌株，它只是筛选的第一步，所得菌种是否具有生产上的实用价值，能否作为生产菌株，还必须采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。如果此野生型菌株产量偏低，达不到工业生产的要求，可以留之作为菌种选育的出发菌株。
4.1.5. 毒性试验
自然界的一些微生物在一定条件下将产生毒素，为了保证食品的安全性，凡是与食品工业有关的菌种，除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌无须作毒性试验外，其他微生物均需通过两年以上的毒性试验。
4.2. 微生物的诱变育种
从自然界直接分离的菌种，一般而言其发酵活力往往是比较低的，不能达到工业生产的要求，因此要根据菌种的形态、生理上的特点，改良菌种。以微生物的自然变异为基础的生产选种的几率并不高，因为这种变异率太小，仅为10—6~10—10。为了加大其变异率，采用物理和化学因素促进其诱发突变，这种以诱发突变为基础的育种就是诱变育种，它是国内外提高菌种产量、性能的主要手段。 诱变育种具有极其重要的意义，当今发酵工业所使用的高产菌株，几乎都是通过诱变育种而大大提高了生产性能。诱变育种不仅能提高菌种的生产性能而且能改进产品的质量、扩大品种和简化生产工艺等。从方法上讲，它具有方法简便、工作速度快和效果显著等优点。因此，虽然目前在育种方法上，杂交、转化、转导以及基因工程、原生质体融合等方面的研究都在快速地发展，但诱变育种仍为目前比较主要、广泛使用的育种手段。
4.2.1. 诱变育种的步骤和方法
诱变育种的步骤如下（图5－18）：
图5－18. 诱变育种的步骤
出发菌株的选择 用来进行诱变或基因重组育种处理的起始菌株称为出发菌株。在诱变育种中，出发菌株的选择，会直接影响到最后的诱变效果，因此必须对出发菌株的产量、形态、生理等方面有相当的了解，挑选出对诱变剂敏感性大、变异幅度广、产量高的出发菌株。具体方法是选取自然界新分离的野生型菌株，它们对诱变因素敏感，容易发生变异；选取生产中由于自发突变或长期在生产条件下驯化而筛选得到的菌株，与野生型菌株较相象，容易达到较好的诱变效果；选取每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变可能效果迭加，积累更多的提高。另外，出发菌株还可以同时选取2~3株，在处理比较后，将更适合的菌株留着继续诱变。
另外，对于基因重组的出发菌株，无论是供体还是受体，都必须考虑与重组方式对应的基本性能，如感受态、性亲和性、噬菌体吸附位点等，还必须考虑标记互补、选择性性状、受菌体的强代谢活性、营养需求、生长速度等，以及与社会公害有关的问题如耐药性、致病性、肠道寄生性等。
同步培养 在诱变育种中，处理材料一般采用生理状态一致的单倍体、单核细胞，即菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态，这称为同步培养。细菌一般要求培养至对数生长期，此时群体生长状态比较同步，比较容易变异，重复性较好。如亚硝基胍诱变时作用于复制叉处，生长旺盛的细胞中复制叉点较多，碱基类似物也在此时期比较容易进入DNA链中。霉菌处理使用分生孢子，应该将分生孢子在液体培养基中短时间培养，使孢子孵化，处于活化状态，并恰好未形成菌丝体，易于诱变。
单细胞(或单孢子) 悬液的制备 这一步的关键是制备一定浓度的分散均匀的单细胞或单孢子悬液，为此要进行细胞的培养，并收集菌体、过滤或离心、洗涤。菌悬液一般可用生理盐水或缓冲溶液配制，如果是用化学诱变剂处理，因处理时 pH值会变化，必须要用缓冲溶液。除此之外，还应注意分散度，方法是先用玻璃珠振荡分散，再用脱脂棉或滤纸过滤，经处理，分散度可达90％以上，这样，可以保证菌悬液均匀地接触诱变剂 ，获得较好诱变效果。最后制得的菌悬液，霉菌孢子或酵母菌细胞的浓度大约为106~107个／ml，放线菌和细菌的浓度大约为108个／ml。菌悬液的细胞可用平板计数法、血球计数板或光密度法测定，但以平板计数法较为准确。
诱变处理 首先选择合适的诱变剂，然后确定其使用剂量。常用诱变剂有两大类：物理诱变剂和化学诱变剂。 常用的物理诱变剂有紫外线、x射线、γ射线(如Co60等)、等离子、快中子、α射线、β射线、超声波等。常用的化学诱变剂有碱基类似物、烷化剂、羟胺、吖定类化合物等。
物理诱变剂中最常用的有紫外线。由于紫外线不需要特殊贵重设备，只要普通的灭菌紫外灯管即能做到，而且诱变效果也很显著，因此被广泛应用于工业育种。紫外线是波长短于紫色可见光而又紧接紫色光的射线、波长范围为136～300nm，紫外线波长范围虽宽，但有效范围仅限于一个小区域，多种微生物最敏感的波长集中在265nm处，对应于功率为15W的紫外灯。它是一种非电离辐射，当物质吸收一定能量的紫外线后，它的某些电子将被提升到较高的能量水平，从而引起分子激发而造成突变；而不吸收紫外线的物质，能量不发生转移，分子也不会激发，不会产生任何化学变化，然而，脱氧核糖核酸能大量吸收紫外线，因此它极容易受紫外线的影响而变化。紫外线的诱变作用是由于它引起DNA分子结构变化而造成的。这种变化包括DNA链的断裂，DNA分子内和分子间的交连，核酸与蛋白质的交联，嘧啶水合物和嘧啶二聚体的产生等，特别是嘧啶二聚体的产生对于DNA的变化起主要作用。
紫外诱变的方法是：将10m1菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器，使用15w功率紫外灯管，照射距离为30cm左右，照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株需处理10 min左右。为准确起见，照射前紫外灯应先预热20~30min，然后再进行处理。不同的微生物对于紫外线的敏感程度不一样，因此不同的微生物对于诱变所需要的剂量也不同。在紫外灯的功率、照射距离已定的情况下，决定照射剂量的只有照射时间，这样可以设计一个照射不同时间梯度的实验，根据不同时间照射的死亡率，作出照射时间与死亡率的曲线，这样就可以选择适当的照射剂量。一般以照射后微生物的致死率在90%~99.9% 的剂量为最佳照射剂量，近来也有倾向于采用杀菌率70%~75%甚至更低(30%~70%)的剂量。一般认为，偏低的剂量处理后正突变率较高，而用较高的剂量时则负突变率较高，但高剂量造成损伤大、回复少。目前趋向采用低剂量、长时间处理，尽管致死率较高，而诱变效果较好。实验时，为了避免光复活现象，处理过程应在暗室的红光下操作，处理完毕后，将盛菌悬液的器皿用黑布包起来培养，然后再进行分离筛选。
CO60属γ射线，是一种高能电磁波，其诱发的突变率和射线剂量直接有关，而与时间长短无关。它能产生电离作用，直接和间接改变DNA结构。直接的效应是导致碱基的化学键、脱氧核糖的化学键、糖-磷酸相连接的化学键的断裂；间接的效应是电离辐射使水和有机分子产生自由基，自由基作用于DNA分子，特别是对嘧啶的作用更强，可引起缺失和损伤，造成基因突变，还能引起染色体断裂，引起倒位、缺失和易位等畸变。不同的微生物对C060的辐射敏感程度差异很大，可以相差几倍，引起最高变异的剂量也随菌种而有所不同。一般照射时多采用菌悬液，也可用长了菌落的平皿直接照射。照射剂量在4~10万伦琴，或者采用能使微生物产生90％~99％死亡率的剂量。电离幅射是造成染色体巨大损伤的最好诱变剂，它能造成不可回复的缺失突变，但可能影响邻近基因的性能。
等离子输入是一种较新的诱变方法，国外自20世纪60年代中、后期相继开始把等离子注入技术应用于生物学领域的研究，国内将离子束作为一种新技术应用于生物等品种改良的研究则是由中国科学院等离子体物理研究所于1986年开创的。低能离子束是以具质量、能量双重诱变效应的特征不同于传统的电磁辐射，它的注入引发的生物效应，机制相当复杂，既有能量的沉积、动量的传递，又有粒子的注入和电荷的交换，可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和膜电场的改良，与γ射线，中子束等明显不同。离子束与生物体作用，首先有能量的沉积，即注入离子与生物大分子发生一系列碰撞，生物大分子获得能量时，键断裂，分子击出原位，留下断键或缺陷；同时还有质量沉积，离子束是高LET粒子，有Braag峰，具有较强的电离作用，还能产生活性高的自由基间接损伤作用，因此它对生物体的作用可导致较高的突变率；另外由于注入离子的不同电荷数、质量数、能量、剂量的组合，提供了众多的诱变条件，通过这种电、能、质的联合作用，将强烈影响生物细胞的生理生化特性，以引起基因突变，所以变异幅度大，有较高的突变率，较广的突变谱；再者突变体的遗传性能比较稳定，回复突变率低。
化学诱变剂 化学诱变剂的种类很多，根据它们对DNA的作用机制，可以分为三大类：第一类是烷化剂，它与一个或多个核酸碱基起化学变化，因而引起DNA复制时碱基配对的转换而发生变异。例如硫酸二乙酯、亚硝酸、甲基磺酸乙酯、N-甲基-N’-亚硝基胍、亚硝基甲基尿等。第二类是一些碱基类似物，它们通过代谢作用渗入到DNA分子中而引起变异，例如 5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘌呤、2-氨基嘌呤、8-氮鸟嘌呤等。第三类是吖啶类，它造成DNA分子增加或减少一、二个碱基，从而引起碱基突变点以下全部遗传密码在转录和翻译时产生错误。选择化学诱变剂时还应注意：亚硝胺和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多，其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯被称为“超诱变剂”， 甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。碱基类似物和羟胺虽然具有很高的特异性，但很少使用，因其回复突变率高，效果不大。
决定化学诱变剂剂量的因素主要有诱变剂的浓度、作用温度和作用时间。化学诱变剂的处理浓度常用几微克~几毫克／毫升，但是这个浓度取决于药剂、溶剂及微生物本身的特性，还受水解产物的浓度、一些金属离子以及某些情况下诱变剂的延迟作用的影响。一般对于一种化学诱变剂，处理浓度对不同微生物有一个大致范围，在进行预试验时，也通常是将处理浓度、处理温度确定后，测定不同时间的致死率来确定适宜的诱变剂量。这里需要说明的是化学诱变剂与物理诱变剂不同，在处理到确定时间后，要有合适的终止反应方法，一般采用稀释法、解毒剂或改变pH值等方法来终止反应。
要确定一个合适的剂量，通常要经过多次试验，就一般微生物而言，诱变频率往往随剂量的增高而增高，但达到一定剂量后，再提高剂量会使诱变频率下降。根据对紫外线、x 射线及乙烯亚胺等诱变剂诱变效应的研究，发现正突变较多地出现在较低的剂量中。而负突变则较多地出现在高剂量中，同时还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，高剂量更容易出现负突变。因此，在诱变育种工作中，目前较倾向于采用较低剂量。
在诱变育种时，有时可根据实际情况，采用多种诱变剂复合处理的办法。复合处理方法主要有三类：第一类是两种或多种诱变剂先后使用；第二类是同一种诱变剂的重复使用；第三类是两种或多种诱变剂的同时使用。如果能使用不同作用机制的诱变剂来做复合处理，可能会取得更好的诱变效果。诱变剂的复合处理常呈现一定的协同效应，这对诱变育种的工作是很有价值的。
中间培养 对于刚经诱变剂处理过的菌株，有一个表现迟滞的过程，即细胞内原酶有量的稀释过程（生理延迟），需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。据此应让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，使细胞的遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，稳定的变异就会显现出来。若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。
分离和筛选 经过中间培养，分离出大量的较纯的单个菌落，接着，要从几千万个菌落中筛选出几个好的，即筛选出所谓性能良好的正突变菌株，这将要花费大量的人力和物力。怎样设计才能花费较少的工作量达到最好的效果，这是筛选工作中的一条原则。一般采用一些方法加以简化，如利用形态突变直接淘汰低产变异菌株，或利用平皿反应直接挑取高产变异菌株等。平皿反应是指每个变异菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物在培养基平板上作用后表现出一定的生理效应，如变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等，这些效应的大小表示变异菌株生产活力的高低，以此作为筛选的标志。常用的方法有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂块培养法等。
4.2.2. 营养缺陷型突变体的筛选及应用
在诱变育种工作中，营养缺陷型突变体的筛选及应用有着十分重要的意义。营养缺陷型菌株是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质(如氨基酸、维生素、嘌呤和嘧啶碱基等)的能力，必须在其基本培养基中加入相应缺陷的营养物质才能正常生长繁殖的变异菌株。其变异前的菌株称为野生菌株。凡是能满足野生菌株正常生长的最低成分的合成培养基，称为基本培养(MM)；在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素及含氮碱基之类的天然有机物质，如蛋白质、酵母膏等，能满足各种营养缺陷型菌株生长繁殖的培养基，称为完全培养基(CM)；在基本培养基中只是有针对性的加入某一种或某几种自身不能合成的有机营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长的培养基，称为补充培养基(SM)。
营养缺陷型菌株的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型和确定生长谱四个环节。诱变剂处理时与其它诱变处理基本相同。在诱变处理后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般很低，通常只有百分之几至千分之几，采用抗菌素法或菌丝过滤法，可以淘汰为数众多的野生型菌株，从而达到浓缩营养缺陷型的目的�？股胤ㄊ抢靡吧途昴茉贛M中生长，而缺陷型不能生长，于是将诱变处理液在MM中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于“休眠状态”，这时，加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。在选择抗生素时，细菌可以用青霉素，酵母可用制霉菌素。 菌丝过滤法只适用于丝状真菌，其原理是在基本培养基中，野生型的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型则不能。因此将诱变处理后的孢子在基本培养基中培养一段时间后，再进行过滤。如此重复数次后，就可以除去大部分野生型菌株，同样达到“浓缩”营养缺陷型的目的。
营养缺陷型的检出方法很多，主要有影印法、夹层法、逐个检出法、限量补充培养法等四种。影印法是将诱变处理后的细胞涂布在完全培养基表面上，经培养后长出菌落，然后用一小块直径比平皿稍小的圆柱形木块复盖于灭过菌的丝绒布上作为接种工具，将长出菌落的平皿倒转过来，在丝绒上轻轻按一下，转接到另一基本培养基平板上，经培养后，比较这两个平皿长出的菌落。如果发现前一平扳上某一部位长有菌落，而在后一培养基上的相应部位却没有，就说明这是一个营养缺陷型菌落。夹层培养法是先在培养皿上倒一层基本培养基，冷凝后加上一层含菌液的基本培养基，凝固后再浇上一薄层的基本培养基。经培养后，在皿底对首先出现的菌落做标记，然后再倒上一薄层完全培养基(或补充培养基)，再培养，这时再出现的新菌落，多数即为营养缺陷型。此法缺点是，结果有时不明确，而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。逐个检出法是将经过诱变处理的细胞涂布在完全培养基平板上，待长出单个菌落后，用接种针或牙签将这些单个菌落逐个依次地分别接种到基本培养基和另一完全培养基平板上。经培养后，如果在完全培养基上长出菌落，而在基本培养基上却不长菌落，说明这是一个营养缺陷型菌株。限量补充培养法是将诱变处理后的细胞接种在含有微量(0.01％以下)蛋白胨的基本培养基上。野生型菌株就会迅速生长成较大的菌落，而营养缺陷型菌株只能形成生长缓慢的微小菌落，因而可以识别检出。如果想得到某一特定缺陷型菌株，则可直接在基本培养基上加入微量的相应物质。
确定生长谱是指采用上法选出的缺陷型菌株经几次验证确定后，还需确定其缺陷的因子，是氨基酸缺陷型，还是维生素缺陷型，或是嘌呤、嘧啶缺陷型。生长谱测定可以用两种方法：一种是将缺陷型菌株培养后，收集菌体，洗涤培养基，制备成细胞悬液后，与MM培养基（融化并凉至50°C）混合并倾注平皿。待凝固后，分别在平皿的5~6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组织营养物的滤纸圆片，培养后会在组合区长出，就可测得所需营养。另一种方法是以不同组合的营养混合物与融化凉至50°C的MM培养基铺成平皿，然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于相应位置，培养后根据在什么组合长出可推知其营养因子。
营养缺陷型菌株不论在科学实验中，还是在生产实践中都具有广泛的用途。利用营养缺陷型菌株定量分析各种生长因素的方法称为微生物分析法。常用于分析食品中氨基酸和维生素的含量，因为在一定浓度范围内，营养缺陷型菌株生长繁殖的数量与其所需维生素和氨基酸的量成正比。这种方法特异性强，灵敏度高，所用样品可以很少而且不需提纯，也不需要复杂的仪器设备。 利用营养缺陷型菌株作为研究转化、转导、接合等遗传规律的标记菌种和微生物杂交育种的标记。由于微生物经杂交育种后形成的杂种在形态上往往与亲本难以区别，因此常常选择不同的营养缺陷型来进行标记，通过测定后代的营养特性，以判断它们杂交的性质。利用营养缺陷型菌株测定微生物的代谢途径，并通过有意识地控制代谢途径，获得更多的我们所需要的代谢产物，从而成为发酵生产氨基酸、核苷酸和各种维生素等的生产菌种，例如利用丝氨酸营养缺陷型可以生产更多的赖氨酸，利用腺苷酸营养缺陷型菌株可提高肌苷酸的产量等。
4.3. 微生物的杂交育种
杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经细胞的互相联结、细胞核融合，随后细胞核进行减数分裂，遗传性状会出现分离和重新组合的现象，产生具有各种新性状的重组体，然后经分离和筛选，获得符合要求的生产菌株。尽管一些优良菌种的选育主要是采用诱变育种的方法，但是某一菌株长期使用诱变剂处理后，其生活能力一般要逐渐下降，如生长周期延长、孢子量减少、代谢减慢、产量增加缓慢、诱变因素对产量基因影响的有效性降低等。因此，常采用杂交育种的方法继续优化菌株。另外，由于杂交育种是选用已知性状的供体和受体菌种作为亲本，因此不论在方向性还是自觉性方面，都比诱变育种前进了一大步，所以它是微生物菌种选育的另一重要途径。但由于杂交育种的方法复杂，工作进度慢，因此还很难象诱变育种那样得到普遍的推广和应用。
4.3.1. 细菌的杂交
细菌的杂交行为是于1946年首次在大肠杆菌K-12菌株中发现并证实的。首先在大肠杆菌K-12菌株中诱发一个营养缺陷型(A—)、不能发酵乳糖(Lac—)和抗链霉素(SM r )以及对噬菌体T l敏感的突变体，可以写成A—B +Lac—SM r T s1；另一菌株诱发成一个营养缺陷型(B—)，能发酵乳糖(Lac+)，对链霉菌敏感(SM s)和抗噬菌体T l的突变体A+B—Lac +SM s T r 1。这两个菌株各自都不能在基本培养基上生长，如果把大约105 /ml浓度的上述两种菌株混合在一起，并接种在基本培养基上，则能长出少数菌落；如果把上述两种菌株分别接种到一个特制的U型管的两端去培养,中间用一片可以使培养液流通,但不能使细菌通过的烧结玻璃隔开,那么在基本培养基上就不会出现菌落。这说明细胞的接触是导致基因重组的必要条件，即细菌通过接合完成了杂交行为。在鼠伤寒沙门氏菌、绿脓杆菌、肺炎克氏杆菌、霍乱弧菌等许多细菌中也发现了没接合现象，但是至今未在革兰氏阳性菌中发现接合现象。细菌的杂交还可以通过F因子转移,转化和转导等发生基因重组,但通过这些方式进行杂交育种获得成功的报道还不多。
4.3.2. 放线菌的杂交育种
放线菌的基因重组于1955年至1957年首先在天蓝链霉菌中发现,以后在其它科、属、种中相继发现。现在常用的放线菌杂交方法主要有三种,即混合培养法、平板杂交法和玻璃纸转移法。国外在金霉素、土霉素、新生霉素等抗生素产生菌的杂交育种方面都有过成功的报道,在我国几乎与国外同时起步开展放线菌基因重组的研究工作,并取得了一定成效。
4.3.3. 酵母的杂交育种
一般而言，杂交育种运用了酵母的单双倍生活周期，将不同基因型和相对的交配型的单倍体细胞经诱导杂交而形成二倍体细胞，经筛选便可获得新的遗传性状。酵母的杂交方法有孢子杂交法，群体交配法，单倍体细胞杂交法和罕见交配法。就啤酒酵母而言，运用罕见交配法更易获得结果。
4.3.4. 霉菌的杂交育种
霉菌的杂交育种主要是通过体细胞的核融合和基因重组，即通过准性生殖过程而不是通过性细胞的融合。
霉菌的杂交育种的步骤为：第一 选择直接亲本。用来进行杂交的两个野生型菌株叫原始亲本。原始亲本经过诱变以后得到各种突变型菌株,假设这种菌株是用来作为形成异核体的亲本,就叫直接亲本。作为直接亲本的遗传标记有多种，如营养突变型、抗药突变型、形态突变型等,目前应用普遍的是营养缺陷型菌株。第二是异核体的形成。在基本培养基上,强迫两株营养缺陷型互补营养，则这两个菌株经过菌丝细胞间的吻合形成异核体。由直接亲本形成异核体的方法有：完全培养基液体混合培养法、完全培养基斜面混合培养法、液体有限培养基混合培养法、有限培养基平板异核丛形成法、基本培养基斜面衔接接种法、基本培养基平板穿刺法等。第三是双倍体的检出，检出双倍体的方法有很多种，如用放大镜观察异核体菌落表面，如果发现有野生型颜色的斑点和扇面，即可用接种针将其孢子挑出，进行分离纯化，即得杂合双倍体�；蛘呓罅恳旌颂彐咦臃掷胗诨九嘌桨迳洗又谐こ鲆吧驮跃洌涮舫龇掷氪炕�，即得杂合双倍体。第四是分离子的检出�？梢杂醚≡裥耘嘌秆》掷胱樱部梢越雍纤短宓ユ咦臃掷胗谕耆嘌桨迳�，培养至菌落成熟，检查大量双倍体菌落，在一些菌落上有突变颜色（隐性标记）的斑点或扇面出现，从每个菌落接出一个斑点或扇面的孢子于完全培养基斜面上，培养后经过纯化和鉴别即得分离子。
4.4. 原生质体育种
原生质体育种技术主要有原生质体融合、原生质体转化，原生质体诱变育种等。原生质体融合育种是基因重组的一种重要方法，由于它具有一系列的特点，所以目前已为国内外微生物育种学者所广泛研究和应用。
由于细胞壁是微生物细胞之间进行物质交换的主要障碍之一，用一些方法将细胞壁去除后在高渗条件下形成类似球形的原生质体，在原生质体融合时又加入融合促进剂聚乙二醇（PEG）和Ca++，所以微生物原生质体间的杂交频率都明显高于常规杂交法，霉菌与放线菌已达10—l ~10—2，细菌与酵母已达10-5~10-6。原生质体融合受接合型或致育型的限制较小，二亲株中任何一株都可能起受体或供体的作用，因此有利于不同种属间微生物的杂交。已报道的丝状真菌种间的原生质体融合主要是曲霉属和青霉属；属间原生质体融合主要在酵母中实现：热带假丝酸母×饰针复膜孢酵母，酿酒酵母×彭贝裂殖酵母等。原生质体融合是二亲株的细胞质和细胞核进行类似的合二为一的过程，因此可以想象遗传物质的交换更为完整，提高菌株产量的潜力更大。原生质体融合可以是两株以上的亲株同时参与融合，如研究表明两个亲株的融合频率为2.8×10-2，三个亲株的融合频率为4×10-4，四个亲株的融合频率为4.9×10-7。
原生质体融合育种的步骤是：标记菌株的筛选和稳定性验证 ，原生质体制备，等量原生质体加聚乙二醇促进融合，涂布于再生培养基、再生出菌落，选择性培养基上划线生长、分离验证、挑取融合子进一步试验保藏，生产性能筛选。
前面已经提到转化在工业微生物遗传改良及基因工程中占有十分重要的地位。但除少数细菌外，多数微生物的自然转化能力很低，特别是真核微生物几乎很少能发现自然转化。这主要是因为转化的必备条件之一是感受态的存在，经过人工诱导法可使一些微生物获得感受态，已成功的例子如枯草芽抱杆菌、大肠杆菌等并得到广泛应用。但在链霉菌及真菌中，人工诱导法实现完整细胞的转化的成功例子就不多了。原生质体技术出现后不久，Bibb等发现，当有PEG存在时，质粒DNA可以很高频率转化链霉菌原生质体，从而彻底摆脱了转化依赖感受态出现的限制。在真菌中巳成功地进行原生质体转化的菌株如酿酒酵母、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉等。
图5－19. 基因工程技术的主要操作步骤示意图
4.5. 基因工程技术用于工业菌种改良
基因工程技术又称基因操作、基因克隆、DNA重组等，是一个将含目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，转入一个受体细胞并使之扩增、表达的过程。因此比其它育种方法更有目的性和方向性，效率更高。其全部过程大体可分为以下6个步骤（如图5－19）：目的基因的获得；载体的选择；含目的基因的DNA片段克隆入载体中构成重组载体；将重组载体引入宿主细胞内进行复制、扩增；筛选出带有重组目的基因的转化细胞；鉴定外源基因的表达产物。
目的基因的获得 目的基因的获得一般有四条途径；从生物细胞中提取、纯化染色体DNA并经适当的限制性内切酶部分酶切；经反转录酶的作用由mRNA在体外合成互补DNA(cDNA)，此主要用于真核微生物及动，植物细胞中特定基因的克隆；化学合成，主要用于那些结构简单、核苷酸顺序清楚的基因的克��；从基因库中筛选、扩增获得，目前认为是取得任何目的基因的最好和最有效的方法。
载体的选择 基因工程中所用的载体系统主要有细菌质粒、粘性质粒、酵母菌质粒、λ噬菌体、动物病毒等。载体一般为环状DNA，能在体外经限制酶及DNA连接酶的作用同目的基因结合成环状DNA (即重组DNA)，然后经转化进入受体细胞大量复制和表达。
重组栽体的构建 DNA体外重组是将目的基因用DNA连接酶连接到合适的载体DNA上，可采用粘端连接法和末端连接法。
工程菌的获得 经重组DNA的转化与鉴定，得到符合原定的“设计蓝图”的工程菌。