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王华
中国检验认证集团山东有限公司
摘要：在HACCP体系的建立和实施过程中，控制病原微生物一直是各类食品加工的重点。快速检测食品中病原微生物不仅有利于食品安全管理体系及时验证控制措施实施效果，而且有利于对潜在不安全产品迅速采取纠正和纠正措施。对食源性病原微生物进行准确、灵敏、省时、省力和省成本的快速检验方法已经成为保证食品安全的迫切需求。食品检测中常用的病原微生物快速检测方法包括分子生物学技术、免疫学技术、代谢技术、纸片法、细菌直接计数法、噬菌体鉴定技术、全自动微生物分析系统等。本文对上述各种快速检测食品中微生物的方法的研究进展作一综述。
关键词：快速检测；病原微生物；食品；安全
Progress of the Quick Inspection Methods of
Pathogenic Microorganisms in Food
Abstract: During the establishing and implementation of HACCP and Food Safety Management System, the most important thing is always the controllment of pathogenic microorganism. The quick inspection methods for pathogenic microorganism in food are benefit for not only verifing the control measures in time, but also taking corretion and correction measures to potential unsafety food. It is necessary for food safety to make quick inspection of pathogenic microorganisms, for the virtue of accuation, sensitivity, time-saving, labor-saving and low costaction. The quick inspection methods of pathogenic microorganisms in the food include molecular biology detection method, immunology method, metabolic method, quick inspection paper, bacterium direct counting method, automatic microbial monitoring system etc. This article has summarized the quick inspection methods of pathogenic microorganisms in the food.
Key words: Quick inspection；Pathogenic Microorganisms；Food；Safety
食品安全问题一直是各国政府和人民群众最为关心的问题，由病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要的因素之一。在HACCP体系的建立和实施过程中，病原微生物一直是各类食品加工行业控制的重点。目前，传统的食源性病原菌的检测、鉴定仍停留在分离培养、形态观察、生化鉴定和血清学分型水平。这些方法操作烦琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁重，检测周期较长，而且无法对难以培养的病原菌进行检测，因此病原微生物的检测结果往往存在不同程度的滞后性。这不仅不利于食品安全管理体系及时验证控制措施实施效果，而且不利于对潜在不安全产品迅速采取纠正和纠正措施。对食源性致病菌进行准确、灵敏、省时、省力和省成本的快速检验方法已经成为保证食品安全的迫切需求。
1 常用的食品病原微生物快速检测技术
1.1 分子生物学技术
1.1.1 多聚酶链式反应技术（PCR）
PCR的基本原理是在体外对特定的双链DNA片断进行高效扩增，故又称基因体外扩增法。通过体外酶促反应合成特异性DNA片段，再通过扩增产物来识别细菌。由于PCR灵敏度高，理论上可以检出一个细菌的拷贝基因，因此在细菌的检测中只需短时间增菌甚至不增菌，即可通过PCR进行筛选，节约了大量时间。但PCR技术也存在一些缺点：食物成分、增菌培养基成分和其他微生物DNA对Taq酶具有抑制作用，可能导致检验结果假阴性；操作过程要求严格，微量的外源性DNA进入PCR后可以引起无限放大产生假阳性结果；扩增过程中有一定的装配误差，会对结果产生影响。美国快力康公司推出了全球第一台PCR全自动检测仪BAX系统，克服了手工操作PCR的缺点，能用于检测细菌，敏感性和特异性都非常好。
1.1.2基因探针技术
DNA探针是利用同位素、生物素等标记的特定DNA片断。DNA探针技术又称分子杂交技术，是利用DNA分子的变性、复性以及碱基互补配对的高度精确性，采用高度特异性基因片段制备基因探针来识别细菌的新技术。法国生物一梅里埃公司的GEN?PROBE基因探针检测系统，能够在30分钟内完成对于分离到的单个菌落的确证试验[1]。目前，DNA探针技术已经在沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌及乙型肝炎病毒等检测中得到了应用。基因探针的优点是减少了基因片段长度多态性所需要分析的条带数，但是缺点是不能鉴定目标菌以外的其他菌。
1.1.3 基因芯片技术
基因芯片是采用微加工和微电子技术将各种基因寡核苷酸有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上而得到的一种信息检测芯片。微生物样品DNA经PCR扩增后制备荧光标记探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，通过扫描仪定量分析荧光分布模式从而来确定检测样品是否存在某些特定微生物。理论上，基因芯片可以在一次实验中检出所有潜在的致病原，也可以用同一张芯片检测某一致病原的各种遗传学指标，具有简便快速、特异性强、灵敏度高、可并行检测等优点，因而在食品检测领域有着广泛的发展前景。李君文[2]等建立了以基因芯片技术为基础的水中常见致病菌的快速检测与鉴定技术，其检测水中常见致病菌的敏感性可达5．6×10 个／mL细菌菌落的核酸。Carl等[3]对大肠埃希菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌和空肠弯曲菌采用了基因芯片的检测方法，其检测结果不仅敏感度高于传统方法，而且操作简单，重复性好，并且节省了大量时间，大大提高了4种细菌诊断效率。Volokhov[4]通过单管复合体PCR扩增和基因芯片技术成功地检测和鉴别了6种李斯特菌。Call等[5]通过分析E．coli O ：H 的Shiga样毒素I,Shiga样毒素Ⅱ及溶血素A，发现基因芯片可准确检测各种E．coli O157：H7分离物。
然而，基因芯片技术刚刚发展起来，许多地方还有待改进，如检测成本高昂；检测特异性有待提高；样品制备过程应该进一步简化以及建立标准化程序等。
1.2 免疫学技术
免疫学技术通过抗原和抗体的特异性结合反应，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌。免疫法有较高灵敏度，样品在进行选择性增菌后，抗原和抗体的结合反应可在很短时间内完成达到检出度，不需分离，即可采用免疫技术进行筛选。
1.2.1 乳胶凝集反应
乳胶凝集反应是利用抗原与抗体特异性结合的特性，加上人工大分子的乳胶颗粒而发生肉眼可见的凝集反应。Aureus Test用于食品样品中金黄色葡萄球菌的检测，该试剂盒中含有对免疫抗蛋白A Ig G和鞭毛蛋白敏感的聚苯乙烯乳胶粒子，因细菌蛋白A和Ig G结合，凝聚酶和鞭毛抗原结合，所以当含有金黄色葡萄球菌的样品悬浮液加入含乳胶粒子的试剂盒中时1分钟内将产生凝集反应。该法的灵敏度和特异性均较高。
1.2.2 酶联免疫法（ELISA）
ELISA是把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机地结合起来的一种检测技术，它既可测抗原，也可测抗体。ELISA法可用于检测食品中李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157、弯曲杆菌、假单胞菌属、致贺氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌等。赵志晶等[6]建立了适宜食品样品中大肠杆菌O157：H7，检测的双抗ELISA方法，经过增菌，鸡肉与牛奶染菌样品中的检出限为0.1CFU／g(CFU/mL)。Cryan等[7]在研究大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli．)内毒素时，将ELISA法与DNA探针技术等进行比较，发现ELISA技术更灵敏、快速。此外，ELISA法还可用于食品介导的病毒的检测，目前我国已完成了禽流感流行株的分离和鉴定、禽流感重组核蛋白诊断抗原的研制及应用，建立了禽流感免疫酶诊断方法和技术，已具备试剂盒生产能力。
1.2.3 免疫磁性分离法
免疫磁性分离方法，是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，与样品中被检致病微生物发生特异性结合，载有致病微生物的磁性颗粒在外加磁场的作用下，向磁极方向聚集，通过弃去检样混合液，使致病微生物不但得到分离，而且也得到浓集的方法。由于食品检样常为固液多相混合体，采用常规方法难以将少量的致病微生物分离出来。免疫磁性分离技术以其特有的性能，在食品卫生检测和研究中取得了较好的结果。Skjelse等[8]报道了用免疫磁性分离技术从乳及乳制品、肉类和蔬菜中分离出沙门氏菌，其检测限为10-20个/g。Chapman等[9]报道了在英国由牛奶引起的大肠杆菌O157:H7感染，可疑食物通过微生物学方法得到证实，但检验结果的准确快捷主要缘于免疫磁性分离技术的成功应用。Skjerve等[10]用抗李斯特菌鞭毛抗原的单克隆抗体包被磁性微球，捕获增菌食物中的单核细胞增生性李斯特菌。采用免疫磁珠法可有效地收集、浓缩副溶血性弧菌，可显著提高环境样品及食品中病原性副溶血性弧菌的检出率[11] 。
1.2.4 微型自动荧光酶标分析法(mini VIDAS)
mini VIDAS是利用酶联荧光免疫分析技术，通过抗原-抗体特异反应，分离出目标菌，由特殊仪器根据荧光的强弱自动判断样品的阳性或阴性。VIDAS法检测食品沙门菌较常规法敏感特异，用其检测为阴性的样品能很快作出非沙门菌的判断，比常规法可提前2～3天。VIDAS法用于进出口冻肉的检测，可大大缩短检验时间，加快通关速度[12]，检测冻肉中李斯特氏菌亦如此[13]。
1.3 代谢技术
1.3.1 ATP生物发光法
ATP生物发光法是近年发展较快的一种用于食品生产加工设备洁净度检测的快速检测方法。利用ATP生物发光分析技术和体细胞清除技术测量细菌ATP和体细胞ATP，推算出样品中的含菌量。由于生物发光法无需培养过程，操作简便、灵敏度高，因此在短时间内即可得到检测结果，具有其它微生物检测方法无可比拟的优势。ATP 生物发光分析技术已经用于肉类食品细菌污染状况及食品器具的现场卫生学检测[14][15]。
1.3.2 电阻抗技术
电阻抗法的原理是细菌在生长繁殖中，将培养基中的碳水化合物、蛋白质和脂类等大分子电惰性物质，代谢为具有电活性的乳酸盐、醋酸盐等小分子物质，使培养基的阻抗发生变化，通过检测培养基的电阻抗变化情况，判定细菌在培养基中的生长繁殖特性，检测出相应的细菌。该法具有检测速度快、灵敏度高、准确性好等优点，目前已经用于细菌总数、霉菌、酵母菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等的检测。。Martins 和Selby 用直接阻抗法精确测定了污染肉制品中大肠菌的含量。Quinn等[16]分别用传统培养技术与3种快速检测方法(阻抗法、基因探针法和沙门氏菌示踪法)对禽类饲料和环境样品中的沙门氏菌进行检测，阻抗法是几种方法中最少受到主观因素干扰的。Pless等[17]分别用阻抗法和传统检测方法进行对照试验，对250种食品样品进行了检测。在122种沙门氏菌阳性样品中，用阻抗方法检出的有119种，传统的亚硒酸盐一胱氨酸培养基检出106种，用RV培养基仅检出92种。
1.3.3 其他的代谢技术
放射测量技术是利用细菌在生长繁殖过程中代谢碳水化合物而产生CO2的原理，把微量的放射性14C标记引入碳水化合物分子中，通过测定14CO2 的含量，从而判断细菌的数量。目前，该法已用于测定食品中的细菌，具有快速、准确度高和自动化等优点[18]。
微热量技术是通过测定细菌生长时热量的变化进行细菌的检出和鉴别。通过建立与绝对微生物细胞数相关的温谱图，可以用微热量对微生物进行计数。
接触酶测定技术是通过计算一个含有接触酶的纸盘在盛有H202的试管中的漂浮时间来估计菌数。当样品接触酶阳性细菌含量越高，接触酶与H202反应放出氧气越多，纸盘上浮的时间越短。大多数腐败微生物是嗜冷性细菌，而大多数嗜冷细菌接触酶呈阳性，故可以用接触酶反应来估计食品中的嗜冷性菌群。
1.4 其他快速检测技术
1.4.1 纸片法
目前已经有许多微生物检测纸片，可分别检测菌落总数、大肠菌群、霉菌、沙门菌、葡萄球菌等，这些纸片快速检测与传统检测方法之间的相关性非常好。如用大肠菌群快检纸片检测餐具的表面，操作简便、快速、省料，特异性和敏感性与发酵法符合率高，已经被列为国标方法。美国3M公司生产的PF (Petrilm)试纸还加入了染色剂、显色剂，增强了效果，而且避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷。在大肠菌群检测方面，国际方法报告的是MPN值而不是每克食品中的大肠菌群数，PF法则可以得出精确数据[19]。霉菌快速检测纸片操作简便，不需要低温设备，仅需36℃培养48小时就可观察结果，比国标法缩短3～5天，在霉菌检出率上无显著性差异，且菌落典型，易判定,大大提高了工作效率。利用细菌产生某些代谢酶或代谢产物的特点而建立的纸片荧光法已经用于检测食品中大肠菌群、大肠杆菌，通过检测365nm紫外光下的荧光产物，判断有关酶的活性，从而达到检测的目的。纸片可高压灭菌处理，4℃保存，简化了实验准备、操作和判断。
1.4.2 细菌直接计数法
细菌直接计数法主要包括流式细胞仪(FCM)和固相细胞计数(SPC)法。FCM通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。光散射信号基本上反映了细胞体积的大��；荧光信号的强度则代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，由此可通过仪器检测散射光信号和荧光信号来估计微生物的大小、形状和数量。流式细胞计数具有高度的敏感性，可同时对目的菌进行定性和定量分析。目前已经建立了细菌总数[20]、致病性沙门菌、大肠埃希氏菌[21]等的FCM检验方法。MClelland RD和Dinder AC用该仪器结合单克隆抗体检测食品中的沙门氏菌，灵敏度达到0.1CFU/g。SPC可以在单个细胞水平对细菌进行快速检测[22]。滤过样品后，存留的微生物在滤膜上进行荧光标记，采用激光扫描设备自动计数。对于生长缓慢的微生物，检测用时短使该方法明显优于传统平板计数法。
1.4.3 噬菌体鉴定技术
噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，细菌基本上都有自己的噬菌体，而且具有专一的寄生性，以及生长速度快等特点，常被用来鉴定一些特定的致病菌，其中以鉴定肠杆菌科细菌和金黄色葡萄球菌最具成效。史玲等利用肠杆菌科噬菌体进行食品和餐具细菌检测，对沙门氏菌和志贺氏菌的检测仅需24-30小时。
1.4.4 全自动微生物分析系统(AMS)
Vitek?AMS自动微生物检测系统是一种由传统生化反应及微生物检测技术与现代计算机技术相结合，运用概率最大近似值模型法进行自动微生物检测的技术。AMS以每种细菌的微量生化反应为基础，无须经过微生物分离培养和纯化过程，就能直接从样品检出特殊的微生物种类和菌群来，可鉴定405种细菌[23]。AMS能同时进行60-200个样品的分析，速度快、易操作、结果准确。用AMS鉴定沙门菌属只需4小时，鉴定志贺氏菌属只需6小时，鉴定霍乱弧菌等致病性弧菌亦只需4-13小时[24]。
2 食品病原微生物快速检测技术的发展方向
微生物快速检测技术都各自表现出很多优点，但也还存在着不足。由于被污染食品中微生物种群繁多，成分复杂，各种食品中都可能存在阻碍检测准确性的抑制因素，另外，受污染食品中的同属相似菌，操作过程中的微小误差都会严重干扰检测结果。目前，多数快速检测方法还仅仅作为筛选方法使用，在实践中起到参考作用。不断完善和改进现有的快速检测技术，建立更灵敏、更有效、更可靠、更简便的检测技术，是食品病原微生物快速检测技术的发展趋势。
2.1 充分发挥不同快速检测技术优势
目前采用的快速检测方法还有许多需要完善的地方，如快速往往伴随准确性的降低，如普遍使用的酶联免疫法还有假阳性的问题存在。在实践中使用快速检测技术，必须熟悉各种快速方法的优缺点，尽量选择标准中推荐的快速方法或权威机构认可的快速方法，在不同的应用中发挥快速检测技术的优势。
2.2 提高检测产品质量，使检测更准确
快速检测技术的特异性、灵敏度很高，相关试剂的质量对检测结果的影响很大。应采用新的工艺，提高实验相关产品的质量，优化设计特殊培养基，对于检测结果的准确性具有十分重要的意义。
2.3 实现快速检测标准化、国产化
目前我国采用的大多数是国外的快速检测技术，检测成本高，缺乏相应国家标准。在以后的工作中，应采取多种方法，引进、消化国外的先进技术，生产出我国自己的快速检测产品。同时积极组织研究所、大专院校和企业的专家建立国家标准和规范，推动我国快速检测技术的发展。
随着科学技术的发展和人们对食品安全的重视程度的不断增强，食品中病原微生物的快速检测将在食品工业原料质量估测、加工工艺评估、成品质量检测、产品货架期预测等方面得到越来越广泛的应用，在食品安全管理体系的建立和实施中发挥越来越重要的作用。这些快速检测技术的推广应用，不仅是对传统的食品安全检测技术的一个改进和提高，也使我们的食品质量安全有了进一步的保证，从而推动食品工业更加健康、快速向前发展，改变人类的生活质量，满足人民提高健康水平的需要。随着科学技术的不断进步，相信会有更多快速、简便、特异的检测技术得到应用，以满足人们对食品安全的更高需求。
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