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三、微生物学验证：生物指示剂挑战试验
核心目标：通过定量接种耐热微生物孢子，验证灭菌工艺的致死能力(即杀灭对数)。
1. 生物指示剂(BI)选择
- 菌种：
- 需氧菌：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)孢子，耐热性强(D值=1.53分钟@121℃)，适用于湿热灭菌验证。
- 厌氧菌：嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)孢子，更常用(D值=1.53分钟@121℃)，适用于密封罐体灭菌。
- 孢子浓度：每支BI含1×101×10 CFU( Colony Forming Unit，菌落形成单位)，确保灭菌后杀灭对数≥6(即存活概率<10)。
2. 布点与操作
- 布点原则：
- 覆盖所有可能的灭菌死角：罐体底部排水口、进料管末端、空气分布器、换热器盘管死角、阀门盲端等。
- 每个关键位置放置2支BI(平行样)，总布点数≥10个(小型罐)或≥20个(大型罐)。
- 操作步骤：
1. 将BI放入透气性包装(如无纺布)，避免直接接触蒸汽导致孢子提前失活。
2. 灭菌前按布点图固定BI，可通过支架或耐高温胶带定位。
3. 灭菌后取出BI，一支进行培养(培养基为胰蛋白胨大豆肉汤，5560℃培养4872小时)，另一支作为阳性对照(不灭菌直接培养)。
4. 结果判定：培养后观察是否有浑浊或菌落生长，若所有BI均无菌生长，视为灭菌合格；若有阳性结果，需扩大验证范围并调整灭菌参数(如延长保温时间、提高温度)。
四、验证周期与异常处理
1. 常规验证周期
- 定期验证：
- 新建/改造罐体：投产前需通过至少3次连续成功的验证(物理+化学+微生物)。
- 正常生产：每612个月进行一次全面再验证，每年至少一次微生物学验证。
- 触发再验证场景：
- 更换灭菌工艺参数(如温度从121℃调整为123℃)、罐体结构改造(如新增管道)、灭菌失败事件(如染菌批次)后。
2. 异常情况处理
- 物理参数不达标：
- 检查蒸汽供应(压力、干度)、疏水阀是否堵塞、罐体保温层破损等，修复后重新验证。
- 化学/微生物验证失败：
- 分析灭菌死角原因(如管道坡度不足导致冷凝水滞留)，通过增加布点、调整灭菌程序(如预排水时间从5分钟延长至10分钟)或机械改造(如打磨焊缝消除死角)解决，直至验证通过。
五、文件记录与合规性
1. 验证报告内容：
- 物理参数记录(温度-时间曲线、压力波动图)。
- 化学指示剂变色情况(附照片或图示)。
- 生物指示剂培养结果(菌落计数表、阴性/阳性对照记录)。
2. 合规性要求：
- 符合GMP(药品生产质量管理规范)、FDA(美国食品药品监督管理局)或ISO 13485(医疗器械质量管理体系)等标准，记录需存档至少35年。
- 若用于制药行业，需通过PQ(性能确认)阶段的微生物挑战试验，证明灭菌工艺的重现性和可靠性。
发酵罐灭菌效果验证需遵循“科学布点、多方法交叉验证、动态监控”原则，通过物理参数的精准控制、化学指示物的直观反馈和生物指示剂的定量挑战，确保灭菌无-死角、工艺稳定可靠。
实际操作中，可结合风险评估(如高附加值产品需提高验证频次)和数字化工具(如实时温度云图系统)提升验证效-率，最终保障发酵过程的无菌环境。
核心目标：通过定量接种耐热微生物孢子，验证灭菌工艺的致死能力(即杀灭对数)。
1. 生物指示剂(BI)选择
- 菌种：
- 需氧菌：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)孢子，耐热性强(D值=1.53分钟@121℃)，适用于湿热灭菌验证。
- 厌氧菌：嗜热脂肪芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)孢子，更常用(D值=1.53分钟@121℃)，适用于密封罐体灭菌。
- 孢子浓度：每支BI含1×101×10 CFU( Colony Forming Unit，菌落形成单位)，确保灭菌后杀灭对数≥6(即存活概率<10)。
2. 布点与操作
- 布点原则：
- 覆盖所有可能的灭菌死角：罐体底部排水口、进料管末端、空气分布器、换热器盘管死角、阀门盲端等。
- 每个关键位置放置2支BI(平行样)，总布点数≥10个(小型罐)或≥20个(大型罐)。
- 操作步骤：
1. 将BI放入透气性包装(如无纺布)，避免直接接触蒸汽导致孢子提前失活。
2. 灭菌前按布点图固定BI，可通过支架或耐高温胶带定位。
3. 灭菌后取出BI，一支进行培养(培养基为胰蛋白胨大豆肉汤，5560℃培养4872小时)，另一支作为阳性对照(不灭菌直接培养)。
4. 结果判定：培养后观察是否有浑浊或菌落生长，若所有BI均无菌生长，视为灭菌合格；若有阳性结果，需扩大验证范围并调整灭菌参数(如延长保温时间、提高温度)。
四、验证周期与异常处理
1. 常规验证周期
- 定期验证：
- 新建/改造罐体：投产前需通过至少3次连续成功的验证(物理+化学+微生物)。
- 正常生产：每612个月进行一次全面再验证，每年至少一次微生物学验证。
- 触发再验证场景：
- 更换灭菌工艺参数(如温度从121℃调整为123℃)、罐体结构改造(如新增管道)、灭菌失败事件(如染菌批次)后。
2. 异常情况处理
- 物理参数不达标：
- 检查蒸汽供应(压力、干度)、疏水阀是否堵塞、罐体保温层破损等，修复后重新验证。
- 化学/微生物验证失败：
- 分析灭菌死角原因(如管道坡度不足导致冷凝水滞留)，通过增加布点、调整灭菌程序(如预排水时间从5分钟延长至10分钟)或机械改造(如打磨焊缝消除死角)解决，直至验证通过。
五、文件记录与合规性
1. 验证报告内容：
- 物理参数记录(温度-时间曲线、压力波动图)。
- 化学指示剂变色情况(附照片或图示)。
- 生物指示剂培养结果(菌落计数表、阴性/阳性对照记录)。
2. 合规性要求：
- 符合GMP(药品生产质量管理规范)、FDA(美国食品药品监督管理局)或ISO 13485(医疗器械质量管理体系)等标准，记录需存档至少35年。
- 若用于制药行业，需通过PQ(性能确认)阶段的微生物挑战试验，证明灭菌工艺的重现性和可靠性。
发酵罐灭菌效果验证需遵循“科学布点、多方法交叉验证、动态监控”原则，通过物理参数的精准控制、化学指示物的直观反馈和生物指示剂的定量挑战，确保灭菌无-死角、工艺稳定可靠。
实际操作中，可结合风险评估(如高附加值产品需提高验证频次)和数字化工具(如实时温度云图系统)提升验证效-率，最终保障发酵过程的无菌环境。
