原位杂交定位(in situ hybridization) 这是分子水平和染色体水平相结合的基因定位方法。将待定位基因的特定DNA序列或该基因转录产生的RNA分子作为探针，在标记了放射性同位素或非放射性化学物质后与变性后的染色体DNA杂交，该探针就会同染色体DNA中与其互补的序列结合成为双链，通过放射自显影或显色技术，就可将标记了放射性同位素或非放射性化学物质的探针在染色体上的位置，达到基因定位的目的。
原位杂交基因定位的精度取决于两个因素。一是染色体显带分辨的精细程度。如果染色体是一般的常规染色，则定位只能区分出位于染色体的长臂或短臂，靠近着丝粒或端粒。如果染色体作分带显色，基因就可定位在染色体的某一区带上。染色体显带越精细，则定位也可相应地提高其精度。
另一个因素是探针标记的灵敏度。当用放射性同位素磷(32P)标记探针，杂交后作放射自显影后得到的杂交信号往往很强，会覆盖染色体上很大的区段，不易确定与探针同源的序列所在的精确位置。改用放射性同位素硫(35S)后，情况稍有改善。用非放射性化学物质如荧光素标记探针后，则在荧光显微镜下，探针所在的位置上可呈现出荧光，这称为荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)。当采用可呈现不同颜色的荧光素标记不同基因的探针后，可在同一个中期染色体标本上同时定位几个基因。这种技术同样可用于检测染色体的易位畸变。例如，用某条染色体所特有的重复序列作为探针，当该条染色体的一个片段易位到另一条染色体上时，易位的那个片段将同荧光标记的探针结合而呈现出一片荧光，很易识别。同样，不同的探针标记了不同颜色的荧光素后，染色体将被染成色彩斑斓的图像。这称为染色体涂染(chromosome painting)。