（1）细胞核的分离：将培养的细胞制成细胞混悬液，或以胰蛋白酶消化法于培养盖上收集培养细胞。应用MgSO4染色分离方法分离细胞核（Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章　）。细胞混悬液浓度为5×106/ml。利用RNA酶消化后，使核从细胞分离，细胞核混悬液浓度为4～5×106细胞核/ml。

　　（2）细胞固定和酸的处理：在5ml试管内加冷的100%酒精不断旋转以达到满意的固定。在冰上停留10min。在4℃离心（×150g）10min。重复加三次冷的100%酒精入试管内，离心，倾去。置于冰上10min，再离心。然后加入相当核悬液1/2量的0.1n HCl , 0.5% Triton X-100。室温停留10min。加入IBM-0.25%Triton X-100（IBM配方：50mmol/l KCl, 10mmol/L MgSO4, 5mmol/L HEPES pH8.0）。再离心，重复IBM漂洗（这时细胞核可在不染色情况下，以荧光显微镜观察）后，以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min，继之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5mmol/l MgSO4。在室温静置站立10min。倾去上清液，加IBm -Triton X-100漂洗，离心，使细胞核混悬液最终浓度为108/ml，（可用IBM-Triton X-100稀释约50倍，在血球计数器计数），混悬液镜检应含单个，完整的细胞核。

　　（3）细胞核混悬液杂交

　　①配制杂交混合液：甲酰胺5份，20×SSC1份，50%硫酸葡聚糖2份，pH调至7.0。此原液（stock solution）可贮存在4℃冰箱内。应用时加1份10mg/ml鲱鱼精子DNA（herring sperm DNA）。
　　②混合1μl的细胞核混悬液（108/ml）与18μl的杂交混合液，充分混匀。将此19μl混合液移入1.5ml容积的Eppendorf 管中（核含量约为105）。
　　③加入100ng/每管的AAF标记DNA探针（如为生物素标记DNA探针浓度为20～40ng/每管）。
　　④置70℃10min使DNA探针和核DNA变性。
　　⑤和组织切片与DNA探针杂交方法相较，不同的是在加热变性后切勿置冰上迅速冷却以终止反应，而应迅速转入37℃孵育过夜。

　　（4）杂交后漂洗
　　①在每管中加入1.25ml 50%甲酰胺-2×SSC（pH7.0），在42℃静置10～15min。偶尔旋转以助混匀。冷却至室温。加100μl经dimethylsuberimidate(DEMS)处理的血细胞（107/ml）混匀，离心，室温，10min，轻弹试管使沉淀的小块散开，加入1.25ml 2×SSC(pH7.0)，42℃，继之，静置于室温10～15min，如前离心，再加1.25ml IBM-Triton X-100,室温静置5min，离心。
　　注：DEMS处理红细胞方法：经漂洗并离心去除白细胞和血清的红细胞在盐液如PBS中，细胞含量为108/ml，以K2CO3和DEMS溶液处理3次，第1次：K2CO3为20mmol/L,DEMS为3mmol/L，以后2次：K2CO3依然为20mmol/L，而DEMS为10mmol/L。在应用前将K2CO3和DEMS液混合加入红细胞混悬液中。在最后2次漂洗液中，应用100mmol/l K2CO3将pH调至9～10。在25℃，15min后，加入50μl，100mmol/l 的柠檬酸（citric acid）/每ml细胞混悬液的浓度以达固定红细胞的目的。固定的红细胞离心倾去上清液后，用2×SSC稀释到108/ml，加0.1%叠氮钠可在4℃保存至少1年。

　　（5）AFF标记的荧光显示：加200μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清（NGS），轻轻振荡混匀，室温静置10min，加20μl 1：100的单克隆抗AFF抗体，37℃孵育45min，加1.25ml的PBS-Tween，室温静置10min，加20间歇性振荡，离心，倾去上清液，加200μlPBS含0.05%Tween –2%NGS,振荡，室温静置10min，加20μl的羊抗小鼠–FITC荧光标记抗血清，稀释度1：100～1：300。孵育于37℃45min，加1.25ml PBS –Tween,室温静置10min，离心，倾去上清液。

　　（6）生物素标记探针的荧光显示：加200μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室温静置10min后，加20μl抗生物素标记FITC抗血清15μg/ml，孵育在37℃30min，以1.5ml 4×SSc –0.1% Trion X-100洗1次，加入1.25ml IBm –Triton X-100,室温静置10～15min，间歇振荡、离心。

　　（7）荧光显微镜观察：将细胞核混悬液稀释于250μl的IBM-Trion X-100中，轻加振荡混匀。为抗荧光褪色可加等量的抗褪色溶液至载片上的细胞核涂片上，选择适当的激发波长观察。

　　（8）流式细胞计：将750μl的细胞核混悬液通过流式细胞仪（Flow cytometry, FCM），DEMS处理过的红细胞作为对照（Df 530/30nm, Omega ·Optical Inc, Brattleboro, VT）。