1．原理 用酰化剂3--（4-羟苯基）丙酸—N琥珀酰胺酯（Bolton—Hunter试剂）做连接试剂，将125I标记在羟苯基的2，5位置上，再将琥珀酰胺酯水解，通过一个酰氨键将3--（4—羟基—5—125I—苯基）接在蛋白或多肽的末端氨基上。

　　2．方法 125I—Bolton—Hunter试剂可用氯胺T法自行制备，出已有该试剂的苯溶液作为商品出售。使用时取一定量的标记酯（μmol 蛋白用3～5μmol标记酯），用氮气吹除苯，投入欲标记蛋白5～10μg及缓冲液10～50μl,pH8.0～8.5为宜，在冰浴中反应15～30min后，加入多量氨基酸（如甘氨酸），使过量标记酯消耗掉以终止反应。

　　此法避免了蛋白质与氧化剂的接触，又避免了与放射性碘原子的直接接触，可防止碘源中有害物质对蛋白质的损伤，适用于标记缺乏酪氨酸的蛋白质或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后会引起蛋白质的失活。其缺点是标记技术比较复杂，需要接触较多的放射性，经二步反应，碘标记率比较低。一般认为此法不宜标记短肽，而适于分子量大于1万的蛋白质。