（1）在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。
　  （2）取反应物点样，观察酶切效果。
　　（3）酶切完全后，70℃5min终止反应。
　　（4）加2倍体积的预冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l NaAc混匀，-20℃2h以上。
　　（5）15000rpm离心15min，弃上清。
　　（6）加入75%乙醇洗涤2次，离心弃上清，真空抽干。
　　（7）加入适量1×TE溶解。如此可得线性化载体DNA。
　　（8）测定DNA的含量。
　　（9）加入线性载体DNA和含量3～4倍于载体的待插入DNA片段，连接缓冲液及T4连接酶适量至总体积为20μl，在12～14℃反应12～16h。
　　（10）连接反应液可置-20℃保存，供转化用。