（一）滤膜的准备

提取基因组（染色体）DNA
用适当限制性内切酶（如BamHI、EcoRI、HindIII或Pst I）消化DNA，

重蒸水 11µl

基因组DNA 5µl（3-5µg）

10×缓冲液 2µl

限制性内切酶 2µl

总量为20µl

3. 37℃条件下保温10-24小时。

4. 取2µl样品在0.7-1%凝胶上在TBE溶液中进行电泳检查。

5.确定后，样品与DNA分子量标准一起胶电泳。

6.电泳结束后，在凝胶的侧沿放一把直尺进行拍照，并做标号。

7.将电泳凝胶用蒸馏水冲洗后，放入100ml depurination solution中，室温条件下缓慢振动浸泡15min。（胶显黄色)

8.凝胶蒸馏水冲洗后，转移到100ml 变性溶液中缓慢振动浸泡20分钟，换新的变性溶液，再振动浸泡20分钟。（胶显蓝色）

9.水洗凝胶后，转移到中和溶液缓慢振动浸泡15，然后换溶液后，再浸泡15min。

10.毛细管作用，将DNA从琼脂糖凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。

取出杂交尼龙膜，在其上面做上记号，在6×SSC溶液中非常缓慢转动条件下清洗5min。（含有DNA面朝上）将其从溶液中取出，放在Whatman 3MM滤纸上，让其自然风干。 夹在两张滤纸中，放在80℃条件下烘烤2小时，使其完全固定。

（二）探针的标记

1、取10ng-30g DNA,，用双蒸水定容至15μl.

2、在沸水浴中变性DNA 10 min，迅速放入冰浴中。

3、在变性DNA中添加下列试剂

六聚寡核苷酸 2μl

dNTP标记混合物 2μl

Klenow enzyme 1μl

总体积20μl

4、混匀、少许离心后，在37℃条件下培养。

5、添加2μl的0.2 EDTA（PH8.0）,或者65℃加热10分钟终止反应。

（三）杂交：

1、预热适当体积的DIG Easy Hyb (2ml/100cm2膜)

2、在合适的容器中，预杂交膜30min，柔和摇动，预杂交。

3、在沸水浴中5min，变性大约25mg/ml的DIG标记DNA探针，然后迅速在冰浴中冷却。

4、倒去杂交液，添加探针和杂交液到膜，在缓慢振动情况下保温杂交6h或者过夜。

5、用洗液Ⅰ（2*ssc,0.1℅SDS）在室温条件下洗2次，每次15min。

6、用预热的洗液Ⅱ（0.5*ssc,0.1℅SDS），在65-68℃的条件下，摇动洗2次，每次15min。

（四）免疫检测：

1、 杂交后，洗液中漂洗膜1-5min

2、 在100ml终止液中（blocking solution）,保温30min。

3、 在200ml抗体溶液（Antibody solution）中保温30min。

4、 用100ml洗液洗2次，每次15min。

5、 用20ml检测液平衡2-5min。

6、 在黑暗中，加10ml colorsubstrate 溶液于适当容器中，保温。在显色的过程中不要摇动。（淡色的反应开始在几秒钟，在16小时后完全反应）

7、 膜曝光后短时间内检测显色

8、 用ddH2O或者TE buffer洗膜，终止反应。