一、RAPD技术的原理
RAPD技术是由美国的Williams等人于1990年发明的。它是以聚合酶链反应技术(PCR技术)为基础，利用人工合成的寡核苷酸为引物，以从组织中分离出来的基因组DNA为模板，通过基因放大器合成多态性DNA片段的一种方法。由于不同品种DNA序列存在着差异，其引物结合位点以及两结合位点之间的距离都有差异，这样经PCR扩增后就产生了DNA片段的多态性，从而形成了RAPD标记。RAPD标记具有以下特点：
⑴、标记数量多，因为RAPD分析所用引物的数量是无限的，所以它可以覆盖基因组中所有的位点。
⑵、标记所需模板DNA量小，因此不受季节、组织、器官及发育时期的限制。
⑶、所用引物没有物种限制，一套引物可以用于不同生物基因组分析。
⑷、分析方便、快速、无需克隆自卑、同位素标记、Southern转移等复杂的操作。
⑸、标记是显性的，因此不能区别生物个体是纯合型还是杂合型。
目前，RAPD技术已广泛用于基因定位，寻找特定基因的连锁标记，物种识别，系统进
化，遗传多样性检测，遗传作图和遗传育种等众多领域。
由于RAPD技术是以PCR技术为基础的，因此为了更好的掌握RAPD技术，有必要先了解PCR技术。
1、 PCR技术的原理
多聚酶链式反应技术简称PCR技术，是近年发展起来的一种体外扩增特异DNA片段
的技术，此法操作简单，可在短时间内获得数百万个特异序列的拷贝，因此PCR技术虽然问世时间仅数年，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域。在分子克隆、遗传病的基因诊断、法医学、考古学等方面得到了广泛的应用。
PCR技术与细胞内发生的复制过程十分类似，为在模板DNA、引物（16bp以上，最好为20~24bp）和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。按照反应的特点可将其分为三步：①、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双连解开形成单链；②、退火：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂的多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少；③、延伸：在DNA聚合酶和4种脱氧核苷三磷酸底物及Mg2 存在的条件下，由DNA聚合酶5’→ 3’的聚合酶活性催化以引物为起点的DNA链延伸反应。以上3步为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性DNA片段将得到大量的复制，数量可达到2×106~7拷贝。
2、 RAPD的原理
RAPD技术通常是利用一系列（通常数百个）不同碱基顺序随机排列的寡聚核苷酸单链
（通常为10bp）为引物，对所研究基因组DNA进行PCR扩增。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同，但对于任一一对特定的引物（可相同也可不同），如它们同基因组DNA序列有其特定的结合位点，这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件，即引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3’端相距在一定的长度范围之内（200~2000bp），就可扩增出DNA片断。因此如果基因组在这些区域发生DNA片断插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化，而使PCR产物增加、缺失或发生分子量的改变。通过对扩增产物的检测即可测出基因组DNA在这些区域的多态性，由于进行RAPD分析时可用引物数很大，虽然对每一对引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组，因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。两个物种的个体之间，亲缘关系越接近，其相应的PCR扩增带型也就越相似，反之则差异也就越悬殊。
二、多态性DNA随机放大的条件
大多在Williams等（1990）的基础上变动。一般每一个样品的最后混合液为25ul，其中
含25ul 10×的DNA聚合酶缓冲液（由Tris-HCl，KCl，MgCl2和明胶等配成），各占100umol/L的dATP、dGTP、dCTP和dTTP，0．2umol/L的引物，20~25ng的模板DNA和0．5单位酶量的DNA聚合酶，然后用蒸馏水将混合物加到25ul。
三、影响RAPD的因素
1、引物
引物的合成是随机的，但要满足以下两个条件：G C的含量不低于40%，5’与3’端的碱
基顺序非反方向对称，否则就无法合成专一的少数几条DNA片段。引物的长度以10bp为佳，引物太短（＜9bp）易从模板上脱落，聚合反应难以进行，引物太长，成本提高，合成多态性DNA片段的可能性降低。
引物的浓度通常是0．2umol/L，这一浓度足以完成40个循环的扩增反应，引物浓度过高可能导致错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的几率，这两者均可竞争酶、Dntp和引物。但如引物浓度不足，则PCR的效率极低，扩增产物的产量太低。
2、Taq DNA聚合酶：
酶在70℃~75℃时具有最高的活力，此温度下每一个酶蛋白分子每秒可延伸约150个核苷酸，温度升高（＞80℃）或降低（＜70℃）时，聚合酶延伸速度明显下降。该酶具有良好的热稳定性，95℃保温2小时，活性未见明显损失。
该酶具5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活力，但无3’→5’的外切酶活力，因此，如PCR反应中发生某些核苷酸的错配，该酶没有校正功能。
该酶为Mg2 依赖性酶，MgCl2浓度在2．0mmol/L时酶活力最高，Mg2 浓度偏高，酶活力受抑制。由于Mg2 能与负离子或负离子团（如磷酸根等）结合，在PCR反应中模板DNA、引物及dNTP均可与Mg2 结合，尤以dNTP的影响最大，所以MgCl2浓度在不同反应体系中应适当进行调整，一般反应中Mg2 浓度至少应比dNTP总浓度高出0．5~1．0mmol/L。
KCl的最适浓度是50mmol/L，高于75mmol/L时PCR反应明显抑制，均衡的dNTP有利于酶活性的发挥，并能减少错配和获得多量的特异性DNA扩增产物。
在25ul反应体系中，聚合酶的用量为1~2U，根据扩增片断的长度及复杂程度（G C含量）不同而有所区别，使用聚合酶浓度过高，可引起非特异产物的扩增，浓度过低，则合成的产物量减少。
3、底物（dNTPs）
dNTPs溶液应在-20℃存放，过多的冻融会使dNTPs降解。在RAPD反应中，dNTPs浓
度系在饱和浓度(200umol/L)下使用，dNTPs浓度过高可加快反应速度，同时还可增加碱基的错误掺入率和实验成本，反之，低浓度的dNTPs会导致反应速度的下降，但可提高试验的精确性。4种dNTPs在使用时必须以等当量浓度配制，以减少错配误差和提高使用效率，此外，由于dNTPs可能与Mg2 结合，因此，应注意Mg2 浓度和dNTPs浓度之间的关系。
4、反应的缓冲液
缓冲液成分：50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl （室温下pH=8．4）
1．5mmol/L MgCl2
缓冲液中能影响反应的特异性和扩增片断的产率，在一般的PCR反应中，1．5~2．0mmol/L是比较合适的（对应dNTP浓度为200umol/L左右），Mg2 过量能增加非特异扩增并影响产率。由于Mg2 的最佳作用浓度相当低，因此所制备的模板DNA中不应含有高浓度的鳌合剂，如EDTA，不应含有高浓度的带负电荷的离子基团，如磷酸根。
缓冲液中的BSA和明胶对酶起�；ぷ饔�。KCl在50mmol/L时能促进引物退火，大于此浓度时将会抑制TaqDNA聚合酶的活性。10~50mmol/L Tris-HCl，pH8．4，起调节pH使TaqDNA聚合酶的作用环境维持偏碱性。
5、RAPD的循环参数
PCR扩增是由变性、退火、（复性）和延伸三个步骤反复循环组成的。其中每一步的温度、时间以及循环次数等参数是非常重要的。
⑴、变性
一般选择94℃，30s~1min，可使各种复杂的DNA分子完全变性。应根据模板DNA的复杂程度，调整变性温度和时间。对GC含量高的DNA，应用较高的变性温度和时间。若变性不充分，会影响PCR产物的产量，反之若过度变性（温度过高，时间过长）会对TaqDNA聚合酶活性和dNTP分子造成损坏。RAPD反应由于用基因组DNA，因此变性时间稍长为1min。
⑵、退火
由于RAPD的引物短，因此退火温度应比常规PCR温度（50℃）低，为36℃，温度过高会引起引物从模板上脱落。退火时间也比常规PCR(30s)长，为1min30s，以利于引物与模板DNA的牢固结合。
⑶、延伸
延伸温度应选择在70~75℃之间，此时，TaqDNA聚合酶具最高活力。RAPD反应由于引物过短，延伸温度不利过高，否则不利于引物与模板的结合。RAPD中可采用使反应温度缓慢升高到70~75℃的方法，因为在最初较低温度下，DNA聚合酶已催化延伸反应开始（1．5个bp/s），接下来的较高温度不会对这种延伸过的引物和DNA模板的结合发生影响。延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1分钟延伸足以完成2kb的序列，扩增片段在2kb以上，则需加长延伸时间。RAPD反应由于扩增片段的长度是随机的，有可能有2kb以上的片段，因此延伸时间比常规PCR(1min)长，为1min30s。
⑷、循环次数
RAPD一般为35~40个，循环次数的选择主要取决于模板DNA的浓度，浓度高，则循环次数可降低，过高的循环次数（＞40次），则会增加非特异性产物的量及其复杂度。
5、模板
RAPD反应由于引物序列短，扩增片段随机，因此为获得理想的结果，除模板中不应含有高浓度的EDTA和盐离子外，对模板的纯度要求甚高，OD260/OD280最好在1．8，OD260/OD230 ＞2．0，工作浓度一般为50~100ng。
此外，如模板为环状，则应先将其线状化，因闭环DNA的扩增效率低。
