（一）材料与试剂
1．精制琼脂粉
2．打孔器、加样器、平皿
3．标准阳性血清和标准阴性血清，由指定的生物制品厂购买。
4．马传染性贫血病琼脂扩散用抗原，由指定的生物制品厂购买。
5．pH7.4PBS液
（二）操作方法
1．取琼脂粉1g，加含有1/万硫柳汞的PBS液100ml，水浴加热使之完全融化。
2．取平皿（直径9cm），将融化的琼脂倒入，每个平皿倒入15ml～18ml，使其厚度约
为2.5mm，冷却后加盖，放入4℃～8℃冰箱内，至少4h。
3．按7孔梅花图案打孔，中央孔一个，孔径4mm，外周孔6个，直径6mm，孔距8mm
（中间孔至外周孔的中心距离），封底。
4．中央孔加抗原，2、5号孔加标准阳性血清，其余1、3、4、6孔分别加被检血清，加满为止。加毕后，平皿加盖，平放入铺有数层湿纱布的带盖搪瓷盘内，置15℃～30℃条件下孵育。每日观察一次，连续3天。
（三）结果判定
当标准阳性血清孔与抗原之间出现一条明显致密的沉淀线时，再进行被检血清孔的判定。
阳性：被检血清孔与抗原孔之间形成一条沉淀线，或者标准阳性血清的沉淀线末端向内弯向毗邻的被检血清孔。
阴性：被检血清孔与抗原孔之间无沉淀线，且标准血清阳性孔与抗原孔之间的沉淀线直向毗邻的被检血清孔。
可疑：标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端似乎弯向毗邻被检血清孔，但不易判断。此种结果判为可疑。可疑结果必须进行复试，将抗原做2×，4×，6×，8×等倍数稀释，进行琼脂扩散，观察时间可延长至5d，最后判定结果。