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一. 影响显色反应的因素及反应条件的选择
(20)
(21)
（一）显色反应的选择
1. 选择性好：干扰少或易排除；
2. 灵敏度高（S）：尤其是对低含量组分，一般选择 e：104 ~ 105 L/mol·cm
3. 有色化合物稳定、组成恒定
4. 有色化合物与显色剂的颜色差别大
（二）影响显色反应的因素及反应条件
1. 显色剂的用量
M + R ⇌ MR
待测组分 显色剂 有色化合物
在被测组分一定及其它实验条件不变的情况下，分别测得加入不同量显色剂测得A值，作A-cR曲线，常见以下二种情况：图7 吸光度与显色剂加入量的关系
(a)
在 a 与 b之间任选一点
吸光度与显色剂加入量的关系
(b)
严格控制CR
因此，合适的 cR 通过实验确定。2. 溶液的酸度
(1) 对金属离子存在状态的影响——防止水解，防止沉淀生成
(2) 对显色剂浓度的影响 H2R ⇌ 2H+ + R2-
(3) 对显色剂颜色的影响
pKa pKa
H2R ⇌ H+ + HR- ⇌ 2H+ + R2-
6.9 12.4
黄 橙 红适宜的 pH 通过实验确定：做 A- pH 曲线（其它条件并不变），从中找出 A 较大且基本不变的某 pH 范围。
3. 显色时间：各种显色反应得速度不同，反应完全所需时间不同；有些有色化合物在一定的时间内稳定。
选择方法：作 A-t（min） 曲线，选择在 A 较大且稳定的时间内进行。
4. 显色温度：显色反应一般在室温下进行，但反应速度太慢或常温下不易进行的显色反应需要升温或降温。
选择方法：作 A-T （℃）曲线，选择在 A 较大的时间内进行。
5. 溶剂：实验确定——选择合适的溶剂（常为有机溶剂），提高反应的灵敏度及加快反应速度。
二. 分光光度法测量误差及实验条件的选择
（一）测量误差及 A 范围的选择
任何一台分光光度计都有光度误差 ∆T%，但给定的一台分光光度计， ∆T 基本上是一常数，一般为 ±0.002 ~ ± 0.01，但在不同 T 时同样的 ∆T 对应的 ∆A 则不同，所以引起的∆C/C (浓度的相对误差)就不同。
由 L-B 定律得：
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将此式微分得：
浓度相对误差为：
(21)
设 当 ∆T = ± 0.01时 ，不同 T% 时所对应的 ∆c/c 可从相关表查得：
当 T% = 36.8% 即 A = 0.434时， ∆c/c 最��；
当 T% 在 15-65% 之间 即 A 在0.2 ~ 0.8范围内，∆c/c 较小。
实际测定时：可通过控制溶液的 c 及 b 使 A 在 0.2 ~ 0.8 范围内。
（二）测量波长选择
一般根据吸收光谱选择 lmax 测定——灵敏度高、A 随波长变化小若有干扰，根据“吸收大，干扰小”原则选择l 。
如：3，3’-二氨基联苯（DAB）和 Se 形成配合物 Se-DAB 的最大吸收波长在340nm波长处，DAB也有很强的吸收，在这种情况下，分析波长应选用次大吸收波长420nm，否则测量误差较大。
3. 狭缝宽度
理论上，定性分析采用最小的狭缝宽度，在定量分析中，为避免狭缝太小，出射光太弱而引起信噪比降低，可以将狭缝开大一点。通过测定 A 随狭缝宽度的变化规律，可选择出合适的狭缝宽度。狭缝宽度在某个范围内，A 值恒定，狭缝宽度增大至一定程度时 A 减小，因此：合适的狭缝宽度是 在 吸光度不减小时的最大狭缝宽度。
（三）空白溶液的选择
空白溶液是用来调节工作零点 即 A=0，T%=100% 的溶液，以消除溶液中其它基体组分以及吸收池和溶剂对入射光的反射和吸收所带来的误差。
根据情况不同，常用空白溶液有如下选择：
1. 溶剂空白：当溶液中只有待测组分在测定波长下有吸收，而其它组分无吸收时
— 用纯溶剂作空白；
2. 试剂空白：如果显色剂或其它试剂有吸收，而待测试样溶液无吸收
— 则用不加待测组分的其它试剂作空白；
3. 试样空白：如果试样基体有吸收，而显色剂或其它试剂无吸收
— 则用不加显色剂的试样溶液作空白；
4. 平行操作空白：用溶剂代替试样溶液，以与试样完全相同的分析步骤进行平行操作，用所得的溶液作空白。
