（1）在外层锅内加适量的水，将需要灭菌的物品放入内层锅，盖好锅盖并对称地扭紧螺旋。

（2）加热使锅内产生蒸气，当压力表指针达到 33.78kPa时，打开排气阀，将冷空气排出，此时压力表指针下降，当指针下降至零时，即将排气阀关好。

（3）继续加热，锅内蒸气增加，压力表指针又上升，当锅内压力增加到所需压力时，将火力减小，按所灭菌物品的特点，使蒸气压力维持所需压力一定时间，然后将灭菌器断电或断火，让其自然冷后再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物。

（1）待灭菌的物品放置不宜过紧。
（2）必须将冷空气充分排除，否则锅内温度达不到规定温度，影响灭菌效果。
（3）灭菌完毕后，不可放气减压，否则瓶内液体会剧烈沸腾，冲掉瓶塞而外溢甚至导致容器爆裂。须待灭菌器内压力降至与大气压相等后才可开盖。
（4）装培养基的试管或瓶子的棉塞上，应包油纸或牛皮纸，以防冷凝水入内。
（5）为了确保灭菌效果，应定期检查灭菌效果，常用的方法是将硫磺粉末（熔点为115℃）或安息香酸（熔点为120℃）置于试管内，然后进行灭菌试验。如上述物质熔化，则说明高压蒸气灭菌器内的温度已达要求，灭菌的效果是可靠的。也可将检测灭菌器效果的胶纸（其上有温度敏感指示剂）贴于待灭菌的物品外包装上，如胶纸上指示剂变色，亦说明灭菌效果是可靠的。
（6）现在已有微电脑自控型高压蒸气灭菌器，只需放去冷气后，仪器即可自动恒压定时，时间一到则自动切断电源并鸣笛，使用起来很方便。

最常用的灭菌方法，一般以 101.33kPa处理15～20min，可达到对物品进行灭菌的目的。凡耐高温和潮湿的物品，如常用培养基、生理盐水、衣服、纱布、玻璃器材等都可用本法灭菌。