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常见问题汇总
01
VRBA培养相关问题 1）所用器皿是否需要灭菌？ 不需要。配制培养基所用到的锥形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要灭菌。但必须清洗干净，表面无污渍、无残留。煮沸完成后，取下锥形瓶，用一般常用的软纸覆盖瓶口，并橡皮筋缠绕，待冷却至适宜温度后，即可倾注培养基。在倾注培养基时，须点燃酒精灯，稍微灼烧锥形瓶口。 2）如何保持“煮沸2min”？ 可以用电磁炉或者电热板进行加热煮沸，在该培养基即将煮沸时调低温度。实际操作时，不需要严格按照此要求进行，加热煮沸数秒即可。因为本培养基很难保持煮沸2min，一旦煮沸，则培养基很快上涌、翻腾，若不调低问题或及时采取其它措施，则培养基很有可能在数秒内喷涌出来，严重者可喷涌2米以上、电磁炉周围1-2米范围内都是培养基飞溅的范围。 3）若培养基未用完，是否可以冷藏起来下次用？ 不可以。4789.28中已规定，固体培养基最多允许熔融一次，并且特指经过高压霉菌冷却后的培养基还可以熔融一次后使用。且VRBA培养基冷却后，再次熔融后非常容易喷涌，若温度控制不当，底部培养基熔融后很快就会发生喷涌，即培养基未完全熔融就会发生喷涌现象。 4）倾注完成后是否需要“覆盖一层"?如何覆盖？ 一般情况下不需要覆盖。在实际操作过程中，若检验员初次接触该样品类别，则因为不确定是否会发生菌落蔓延，所以有必要在倾注培养基的时候再覆盖一层，但如此反复多次测试后，若样品中不存在菌落蔓延情况，则以后的检验中都不需要进行覆盖。若重复多次测试后都有蔓延情况，则以后的检验中都需要覆盖，应该在原培养基已凝固或半凝固时再倾注一层培养基。 02
如何确定培养基上长得是不是大肠菌群？
03
两个梯度都涨了菌，如何选取？
若两个连续梯度的4个平板上都要挑取菌落进行证实实验，实际操作时，可灵活操作，如1:10的两个平板上的菌落数分别为120、123，1:100的两个平板的菌落数分别为16,18，严格来讲必须至少在每个平板上分别挑取10个可疑菌落和10个典型菌落进行证实实验，如此需要40根GBLB肉汤管。建议使用镍合金接种环，以为VRBA上生长的菌落大部分在底层、且菌落一般比较大，被培养基覆盖，传统的接种环较细，用以刮去上层培养基比较方便，挑取菌落也比较方便。
04 如何进行证实实验，菌落选取数量？
建议新手们VRBA上的所有不同形态的菌落都进行证实实验。每种不同形态都挑取5-10个进行证实实验（BGLB管足够，建议多挑选几个进行实验）。
05
结果如何计算？ 首先，在VRBA培养24h后进行计数，分别计数可疑大肠菌群和典型大肠菌群的数量。假如在1:10的平板上的可疑大肠菌群有10个，典型大肠菌群有6个；然后进行证实实验，假如10个可疑大肠菌群中有3个证实为阳性，6个典型大肠菌群中有5个证实为阳性，则计算方法如下：最终大肠菌群数=经证实的大肠菌群数=可疑大肠菌群经证实的数量+典型大肠菌群经证实的数量=10×（3／10）×10+6×（5／6）×10＝80。 06
若平板上有很多菌落，最终证实全部为阴性，结果如何计算？
建议新手们认真按照标准进行证实实验，此证实实验操作简单，每一次VRBA上有菌落生长都进行证实实验，如此往复3-4次，对于哪种形态才是大肠菌群均可了然于心。
选取15-150CFU之间的平板，挑选可疑菌落进行证实实验。举例如下：
注意：A. 每种可疑菌落挑取5个，每个菌落放入1根GBLB管中；B. “产气者，记为大肠菌群阳性管‘’，就要求在实验前必须认真筛选BGLB管，凡产气的GBLB管应弃去不用。
选取适宜菌落数的平板挑取菌落进行证实试验，若证实全部为阴性，则需要再挑取更低稀释度的平板上的菌落，建议可疑和典型菌落分别挑取10个进行验证试验，若第二次证实实验均呈阴性，以＜1乘以最低稀释度进行计算。
